自身免疫性疾病及其检验8

第十七章自身免疫性疾病及检验,第一节概述第二节自身免疫性疾病的发病机制第三节常见自身免疫性疾病第四节自身免疫性疾病的检验,第一节 概述,（一）相关概念（二）自身免疫病的特征（三）自身免疫病的分类,(一).相关概念,自身耐受(self-tolerance)： 正常情况下，免疫系统对宿主自身的组织和细胞不产生免疫应答的现象。自身免疫(autoimmunity)： 当某种原因使自身耐受破坏时，免疫系统对自身组织成分发生免疫应答的现象。产生低水平的自身抗体或自身反应性T淋巴细胞。,胚胎期单一祖先细胞分化后形成可识别各种抗原的淋巴细胞克隆。,胚胎期与抗原接触的淋巴细胞自身可被破坏或抑制，成为禁忌克隆。,自身免疫病 : （autoimmune diseases，AID） 是指机体对自身成分发生免疫反应而导致的疾病。是由自身抗体或(和)自身反应性T淋巴细胞介导的自身免疫应答。,自身抗体： 是指抗自身组织，器官、细胞及细胞成分的抗体。 在自身免疫性疾病患者的血中可检测出。,1.可有诱因，也可无诱因，但多数病因不清；,2.患者以女性居多，并随年龄增加发病率增加；,3.有遗传趋向；,4.血清中有自身抗体或自身反应性淋巴细胞。自身抗体在不同的自身免疫病中有交叉和重叠现象。,(二).共同特征：,6.病程较长，多反复发作和慢性迁延。,7.在体外可复制出相关动物病理模型。,8.免疫抑制剂如激素类药物治疗，可取得较好的疗效。,(二).共同特征：,5.疾病的重叠现象，即一个病人可同时患一种以上的自身免疫病。,(三).分类,一、自身抗原的出现二、免疫调节异常三、Fas/FasL表达异常四、遗传因素,第二节 自身免疫性疾病的发病机制,一、自身抗原出现 一系列因生物、物理、化学因素引起的自身组织结构与成分发生改变，并能引起机体免疫系统针对这些成分产生免疫应答的抗原物质。（1）.隐蔽抗原释放甲状腺球蛋白抗原 桥本甲状腺炎精子抗原 男性不育眼晶体蛋白 过敏性眼炎,一、自身抗原出现（2）.自身抗原性质改变 药物刺激药改变血细胞抗原性自身免疫性贫血/血小板减少性紫癜变性IgG 抗变性IgG抗体（类风湿因子）变性IgG-RF复合物沉积于关节滑膜类风湿性关节炎,一、自身抗原出现（3）.共同抗原引发的交叉反应A型溶血性链球菌与人肾小球基底膜有共同抗原决定簇肾小球肾炎柯萨奇病毒感染产生免疫应答可攻击胰岛的细胞糖尿病,二、免疫应答和免疫调节异常 （1）.多克隆刺激剂的旁路活化 EB病毒和超抗原激活HhB细胞抗体（2）. T细胞旁路活化 （3）. 辅助分子表达异常自身反应性T细胞（4）. Th1细胞和Th2细胞功能失衡1型糖尿病SLE,5）、Fas/FasL表达异常,Fas普遍表达于多种细胞包括淋巴细胞表面。,FasL通常出现于活化的T细胞（如CTL）和NK细胞膜上，也可以游离形式存在。,动物实验证明：如果Fas基因和FasL基因发生突变, 引起自身免疫病。,三、生理因素,年龄因素： 年龄 发病率性别因素： 某些疾病女性更易患病。,四、遗传因素,1、自身免疫性疾病中发现疾病特异的基因。类风湿性关节炎编码促皮质激素基因1型糖尿病染色体6q27的IDDM82、研究发现多种自身免疫性疾病的发生率与HLA的某些基因型的检出率呈正相关。,HLA与自身免疫病的关系,第三节常见自身免疫病,AID是由自身抗体和/或自身反应性T细胞攻击破坏自身细胞和组织所致。一、型超敏反应：自身抗体+细胞性抗原二、型超敏反应：自身抗原-抗体复合物介导三、型超敏反应：自身反应性T细胞介导,（一） II型超敏反应细胞损伤机制,产生抗血细胞表面抗原抗体：自身免疫性溶血性贫血 自身免疫性血小板减少性紫癜,产生抗细胞表面受体抗体： Graves病（甲状腺亢进病） 重症肌无力（MG）,产生抗细胞外抗原的自身抗体 肺出血肾炎综合征（ Goodpastures nephritis ）抗基底膜型胶原,相关疾病,Graves disease,抗受体抗体,重症肌无力（MG）,抗乙酰胆碱受体抗体,（二）型超敏反应发生的机制,系统性红斑狼疮（SLE）类风湿性关节炎（RA）,相关疾病,Systemic lupus erythematosusSLE,Immunofluorescent detection ofantinuclear antibody in the serum of an SLE patient,Rheumatoid arthritisRA,Characterized by the presence of rheumatoid factor (antibodies against IgG),（三）型超敏反应发生机制,相关疾病,胰岛素依赖性糖尿病多发性硬化症,第四节自身免疫病的检测,自身抗体的检测免疫球蛋白检测补体检测淋巴细胞检测细胞因子检测,一、 自身抗体,抗自身组织，器官、细胞及细胞成分的抗体。高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫性疾病的重要标志。每种自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱。,常见自身抗体及检测,与RA相关自身抗体：类风湿因子（RF）、抗角蛋白抗体（AKA）抗环瓜氨酸肽抗体（抗）抗核抗体（ANA）抗DNA抗体抗ENA抗体与小血管炎相关的自身抗体：抗中性粒细胞胞质抗体、抗磷脂抗体,一）. 类风湿因子（RF）,是一种抗人或动物 IgG 分子 Fc 片段抗原决定簇的抗体，是以变性 IgG 为靶抗原的自身抗体。类型：以IgM型为主。它与天然IgG结合能力较差，易与变性IgG或免疫复合物中的IgG 结合。,检测方法,胶乳颗粒凝集试验：速率散射比浊法：ELISA：,定性或半定量、灵敏度和特异性不高、只能检测IgM型,快速可定量、准确度和敏感性高于前者、只能检测IgM型,特异性、敏感性、重复性均好可检测不同类型,临床意义,RF者中阳性检出率达到79.6%，其滴度与症状相关，但不能作诊断RA的唯一标准；但在其它自身免疫性疾病（SLE、硬皮病等）及部分老年人RF阳性；但RF阴性不能排除RA的诊断。,IgM型：血清中RF效价80IU/ml并伴有严重关节功能障碍，提示预后不良。IgG型：滑膜液中检出IgG型RF比血清中IgM型RF更有意义；IgA型：血清或滑膜液中检出是RF活动的指标之一。,几种疾病时RF的检出率,1979年Young等发现RA血清中有一种能与鼠食管角质层反应的抗体，并对RA具有特异性，命名为AKA。 主要见于RA患者，其阳性率低为36-59%，特异性高可达95-99%。在非类风湿性关节炎的自免病AKA阳性检出率极低。,二）. 抗角蛋白抗体（AKA）,检测方法,间接免疫荧光法以大鼠食管中段粘膜组织切片作为反应基质。,临床意义,AKA先于疾病的临床表现，可用于RA的早期诊断。AKA与RA活动度相关，高效价常提示RA较为严重。敏感性较低，阴性不能排除的诊断。可与联合检测，提高对的诊断但二者很少平行出现,1998年Schellekens和Girbal Neuhause等证实瓜氨酸殘基是RA特异性抗filaggrin抗体识别表位的必需组成。合成环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide,CCP），以此为抗原基质用ELISA法检测RA患者血清中的抗环瓜氨酸肽抗体。,三）. 抗环瓜氨酸肽抗体（抗）,是类风湿性关节炎(RA)的一种高度敏感和特异的新指标。自2002年3月欧洲诊断试剂公司（EURO-DIAGNOSTICA）推出世界上第一个抗CCP诊断试剂盒以来，越来越多的专家认为抗CCP抗体将成为RA早期诊断的金标准。,三）. 抗环瓜氨酸肽抗体（抗）,检测方法,法,临床意义,该抗体比RF具有更高的特异性（抗CCP抗体：97%，RF：62%），而敏感性相当（抗CCP抗体：80%，RF：79%）。抗CCP在疾病早期可出现阳性，并有很高的阳性预期值（91%）。抗CCP抗体在RA早期患者中的阳性率为79%，因而RA的早期诊断并及时开始恰当的治疗对控制病情非常重要。,四）.抗核抗体（antinuclear antibody,ANA),是一组将自身真核细胞的各种细胞核成分作为靶抗原的自身抗体的总称 ;主要是 IgG 、也有 IgM 、 IgA 和 IgD ；它无器官特异性和种属特异性，故该类抗体可与所有动物的细胞核发生反应。,在大部分自身免疫病呈阳性，但正常老年人有低效价的ANA。细胞核成分复杂，因此产生许多ANA，不同的自身免疫病可形成不同的特征性抗体谱。ANA分类：抗DNA抗体抗组蛋白抗体抗非组蛋白抗体抗核仁抗体,间接免疫荧光法（ indirect immunofluorescence, IIF ）,作为总 ANA 筛选的经典试验；可以小鼠肝细胞印片作为抗原底物片，目前最常用Hep-2 细胞（核质丰富）作为抗原。不同的荧光核型，提示不同的自身免疫性疾病。,培养 Hep-2 细胞作为底物固定于载玻片上；加受检血清：血清中 ANA 与核抗原结合，形成抗原 - 抗体复合物；加 FITC 标记的抗人 IgG ：形成标记抗体 - 抗原 - 抗体复合物；荧光显微镜下观察结果：在底物片上 ANA 荧光着染强度和免疫荧光图形。,操作过程：,均质型包括：抗抗体抗组蛋白抗体抗核小体抗体高效价：SLE低效价：RA,斑点型包括： 抗ENA抗体 抗PCNA抗体高滴度见于MCTD也见于SLE、硬皮病、SS等,核膜型抗dsDNA抗体高效价：几乎仅见于SLE，且提示病情活动,抗核抗体核膜型,抗核仁型抗RNA抗体高效价对硬皮病诊断有一定特异性，但也见于雷诺病。,五）.抗DNA抗体,抗双链DNA（dsDNA)抗体：抗单链DNA（ssDNA)抗体：,特异性达95-100%，诊断SLE标准之一；其效价高低反映疾病的活动性；但敏感性仅为30%-50%。,特异性较差，可见于SLE、其他结缔组织病。,检测方法,间接荧光免疫法：ELISA法RIA法,间接荧光免疫法检测抗dsDNA抗体,请问能否用HEP-2细胞作为抗原基质。可以，但灵敏度较低。那可以用什么可替代HEP-2细胞作为抗原基质，为什么？马疫锥虫或绿蝇短膜虫作为抗原基质。特异性强其动基体由纯净的环状dsDNA构成灵敏度高标本稀释10倍染色阳性即有诊断意义,六).抗ENA抗体,ENA(extractablenuclear antigen)可提取核抗原的总称，可用盐水或磷酸盐缓冲液从细胞核中被提取。主要包括Sm 、 U1RNP 、 Rib、 SSA 、 SSB 、 Jo-1 、 Scl-70 等抗原。,六).抗ENA抗体,不同的自身免疫性疾病可产生不同的抗 ENA 抗体。不同特性的抗ENA抗体在各种自身免疫性疾病中的阳性率有明显差异，有些有很高的特异性。用wester blot进行检测。,从小牛或兔胸腔提取的 ENA 抗原，经 （ SDS-PAGE ）电泳，按分子量大小分离成区带；将各抗原区带转印至硝酸纤维膜；加待检血清加在硝酸纤维膜上：加入酶标记抗人 IgG 抗体：形成抗原 - 抗体 - 酶标记抗体复合物；再加入酶的底物：显色反应，参照此时抗原区带的分子量及各区带的相对位置，可辩读出各特异性抗 ENA 抗体,1、操作过程：,2、结果分析：（抗Sm抗体为例）,Sm抗原由U1、U2和U4-6五个snRNA与多肽组成，该抗原表位位于29kD、28kD、 13.5kD三个位置；,结果报告问题: 1）出现三条带同时出现即为抗Sm抗体阳性，能否确定为SLE? 2）出现三条带中的一条带或两条带能否报告为抗 Sm抗体阳性?,是SLE的标志抗体，阳性率为30-50%。,病例：,患者王某，病初发热，因给予氨苄青霉素而过敏出现皮疹、关节痛，被疑为“SLE”，当时检测总ANA阴性，而多肽抗体中抗13 500阳性，被视为抗Sm阳性，即用大量激素进行“正规”治疗，导致激素的严重不良反应。患者辗转南北，不仅造成了极大的经济损失，而且严重影响了病人的身心健康。,结论：,只出现一条带或两条带不能判断为抗Sm抗体阳性。抗29 00 0、28 000和13 500三条带均阳性的可判断为抗Sm抗体阳性，但要作出SLE的诊断一定要结合临床。 SLE的诊断必须密切结合临床，不能完全依靠自身抗体的检测结果。,3、临床意义：,1）抗Sm抗体：是SLE的血清标志抗体，已列入SLE的诊断标准。阳性检出率3050%，其水平不反映SLE疾病的活动性。对早期、不典型的SLE诊断有很大帮助。但阴性不能排除SLE的诊断。,2）抗核RNP抗体（抗nRNP）：是诊断混合性结缔组织病（MCTD）的重要血清学依据，列入MCTD的诊断标准。在MCTD患者阳性率高达95%。但其无疾病特异性，在其他自身免疫病有一定的检出率，如SLE约30%，SS约20%。由于Sm和RNP是同一分子复合物中的不同抗原位点，因此二者有相关性，常同时阳性。,3）抗SSA和抗SSB抗体：在干燥综合征中阳性率40-95%和40 -95% ，同时检测可提高对干燥综合征的诊断率。另外在SLE中的阳性率为20-60%和10-20% 。4）抗Jo-1抗体：对多发性皮肌炎（PM）具有特异性，阳性检出率达2535%。5）抗Scl-70抗体：是进行性系统性硬皮病（PSS）的特征抗体，阳性检出率4060%。,可同时对多项抗体进行分析，灵敏度高、特异性强，操作简便；目前应用最为广泛。,4、评价：,七）、抗中性粒细胞胞质抗体（antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA),是一组以人中性粒细胞胞质成分靶抗原的自身抗体的总称 ;与临床多种小血管炎性疾病密切相关。主要是 IgG 、也有 IgM 、 IgA 和 IgD ；,分型：胞质型（cANCA）：靶抗原是蛋白酶3(PR3)，为嗜天青颗粒主要成分；核周型（pANCA）：靶抗原是髓过氧化物酶(MPO)，为嗜天青颗粒另一主要成分,检测方法,间接免疫荧光法（IIF）：总ANCAELISA法：特异性ANCA,间接荧光免疫法检测ANCA,将中性粒细胞固定于载玻片上；滴加待测血清并孵育；加入荧光标记的抗人IgG并孵育；荧光显微镜下观察。,cANCA阳性图,pANC阳性图乙醇固定,pANC阳性图乙醛固定,临床意义,ANCA被认为是原发性小血管炎的特异性血清标志物 ;是诊断、疗效观察、病情活动和复发的一项重要指标。韦格纳肉芽肿（WG）的cANCA阳性率高达90%，抗PR3阳性是诊断WG特异性指标。新月形肾小球肾炎其ANCA阳性率高达80%。,八）、其他自身抗体,九) 自身抗体检测的临床应用,首先选择敏感性高、特异性不强的方法进行初筛；再选择特异性高，相关性强的方法。,疑为SLE的患者：发热、蝶形红斑、口腔溃疡等,抗ANA(+),总ANA,实验室诊断为SLE,二、免疫球蛋白检测,在自身免疫性疾病中，由于产生大量自身抗体，故免疫球蛋白含量高于正常值，以IgG升高较为明显；动态观察免疫球蛋白量的变化，可反映疾病的进展情况。,三、补体检测的意义,在以、型超敏反应机制发生的自身免疫性疾病中，补体可参与反应。疾病活跃期时，补体量明显降低；疾病缓解期时，补体含量正常。,四、淋巴细胞检测,淋巴细胞数量及功能的改变是介导免疫病理损伤的重要因素；SLE的活跃期，明显的CD4/CD8亚群倒置，Tc细胞高于稳定期。,第三部分常见自身免疫病及检测,一、系统性红斑狼疮（SLE）,是一个累及多系统多器官，临床表现复杂，病程迁延反复的自身免疫性疾病。由于体内有大量致病性自身抗体和免疫复合物，造成组织损伤。,据估算，我国大约有一百万SLE患者，并呈逐年增加趋势。多发于生育年龄女性。近20年来，由于临床免疫学的飞速发展，SLE的早期诊断和治疗已经不再是难题。据统计，目前我国SLE患者的10年存活率达84以上，已经处于国际先进水平。,一) 诊断标准：,面部蝶形红斑盘状红斑：面部的隆起红斑光过敏：是晒后皮肤过敏口腔或鼻咽部溃疡关节炎：非侵蚀性，2个外周关节浆膜炎,7. 肾脏病变：蛋白尿或细胞管型8. 神经病变：癫痫发作或精神病9. 血液异常：各系细胞减少免疫学异常： 狼疮细胞阳性 抗dsDNA抗体阳性 抗SM抗体阳性 梅毒实验假阳性11. 抗核抗体阳性,抗核抗体阳性,上述11项中，如有4项或4项以上阳性，则可诊断为SLE，其特异性为98%，敏感性97%。,二) SLE的实验室检查,血常规：可有贫血、或白细胞减少、或血小板减少尿液：蛋白尿或出现细胞管型血沉：增快C反应蛋白：增高补体：降低时提示处于活动期。自身抗体：(抗ANA、抗dsDNA、抗Sm抗体）,三) 病例分析,患者周某，女，31岁，主诉“乏力，发热3月余，伴颧部红斑1月余，检出蛋白尿2周余”。3个月前患者无明显诱因出现低热，乏力，1月前出现颧部红斑，2周前检出蛋白尿(+)。查体： T 37.8 P 90次/分 R 21次/分 BP 110/80mmHg 面部蝶形红斑，口腔溃疡，右肾区轻微叩痛，余无特殊。,实验室检查： 血常规：正常 尿常规：尿蛋白(+)，RBC3-8/Hp 肾功能： Cr ： 230umol/L BUN ： 6.0mmol/L N,问：请分析该患者可能患何病？,1.病史： 女性、发热、颧部红斑。 2.查体： 低热、口腔粘膜溃疡、右肾区轻微叩痛 3.实验室检测： 尿常规及肾功检测异常： 提示肾脏病变 考虑系统性红斑狼疮。,自身抗体检测： 总ANA(或/和)抗dsDNA 异常 抗ENA谱,问：做什么检查有助于特异性诊断？,免疫球蛋白、 血沉(ESR)、 C3、 C4：,问：做何检测有助于判断是否在活动期？,结果：,正常值IgG 29.1g/L 12.871.35IgA 3.9g/L 2.350.34IgM 3.1g/L 1.080