植物组织培养母液的配制与保存

植物组织培养母液的配制与保存植物组织培养母液的配制与保存 目的目的 熟练掌握植物组织培养中各种成分或成分组的母液 比需要量大若干倍 的配制方法 实验仪器实验仪器 电子天平 感量为 0 0001g 一般天平 感量为 0 1g 烧杯 100mL 50 mL 25mL 量筒 1000 mL 100 mL 50 mL 容量瓶 200 mL 100 mL 50 mL 25 mL 细口瓶 500 mL 200 mL 100 mL 50 mL 药勺 玻棒 电炉等 实验试剂实验试剂 按培养基配方准备 实验原理实验原理 一 培养基的组成 培养基是植物组织培养中的 血液 血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生 长与分化 因此了解培养基的成分 特点及其配制至关重要 自然状态下生长的绿色植物 由于自身能进行光合作用 并且能合成植物生长发育所需的几乎所有有机成分 加上土壤 中含有较全面的无机和有机营养成分 所以只需在适当的时候施加少量的无机和有机肥 复合成分 植物就可良好的生长 目前所使用的培养基有 10 余种之多 大部分都是在 前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的 例如 White 培养基是 Uspenski 和 Uspenskaia 1925 的藻类培养基演化的结果 被广泛用于根的培养 Cautheret 培养基是 建立在 Knop 营养液 1865 基础上的 以后的培养基大部分是在 White 和 Cautheret 培养基 的基础上改进而成 就目前所使用的各种培养基而言 可将它们的成分划分为几大类 常用的有 MS B5 和 White 培养基等 1 水 水是植物原生质体的组成成分 也是一切代谢过程的介质和溶媒 配制培养基 母液时要用蒸馏水 以保持母液及培养基成分的精确性 防止储藏过程发霉变质 大规模 生产时可用自来水 但在少量研究上尽量用蒸馏水 以防成分的变化引起不良效果 2 无机营养成分 大量元素 主要包括氮 磷 钾 钙 镁和硫六种 微量元素 培养基的微量元素主要包括铁 Fe 锰 Mn 铜 Cu 锌 Zn 氯 Cl 硼 B 和钼 Mo 等 这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用 有的对蛋白质或 酶的生物活性十分重要 有的是参与某些生物过程的调节 3 有机营养成分 包括维生素 氨基酸及其它有机物质等 维生素 硫氨素 维生素 B1 盐酸吡哆醇 维生素 B6 和烟酸 在部分培养基中还添加维 生素 BX 氨酰苯甲酸 维生素 C 抗坏血酸 维生素 E 生育酚 维生素 H 生物素 维生素 B12 氰钴胺酸 维生素 BC 叶酸 维生素 B2 核黄素 泛酸钙和氯化胆碱等 维生素 氨基酸 甘氨酸 氨基乙酸 和肌醇 环己六醇 也是一些培养基的添加成分 其他 在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白 水解酪蛋白 椰子汁 玉米胚 乳 麦芽浸出物 西红柿汁和酵母浸出物等 这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程 有重要作用 如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由 Ca 介导的信号转导 4 碳水化合物 所有的植物组织培养基都需要有碳水化合物作为能源 用作碳源的碳 水化合物通常为蔗糖或 D 葡萄糖 用量通常为 2 4 高者可达 5 亦可用市售的白糖 所代替 但一般应增加用量 而且最好用比较固定的厂家生产的产品 以保证实验的稳定 性 5 植物生长调节物质 常称为激素 生长素类有 NAA 萘乙酸 IAA 吲哚乙酸 IBA 吲哚丁酸 NOA 萘氧乙酸 P CPA 对氯苯氧乙酸 2 4 D 2 4 二氯苯氧乙酸 2 4 5 T 2 4 5 三氯苯氧乙 酸 等 细胞分裂素类主要有 从甜玉米未成熟种子或其他植物中分离到的玉米素 6 4 羟基 3 甲 基 反式 2 丁烯氨基 嘌呤 人工合成的细胞分裂素主要有激动素 KT 6 呋喃氨基嘌呤 6 苄基腺嘌呤 6 BA 2IP 异戊烯氨基嘌呤 和 TDZ thidiazuron 噻二唑苯基脲 等 细胞分裂素常常与生长素相互配合 用以调节细胞分裂 细胞伸长 细胞分化和器官 形成 赤霉素 主要是 GA3 虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究 但在培养基 中很少添加 因为它的作用往往是负面的 乙烯等 6 琼脂或其他支持物 除液体悬浮培养外 就目前情况而言 琼脂是一种极为理想的支持物 一般浓度 0 4 1 质量越差的琼脂用量越大 7 其他添加剂 含天然提取物 抗生素等 活性炭 渗透调节剂 抗生素 抗氧化剂等 二 培养基的选择 选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础 选择合适的培养基主要从以下两个方 面考虑 一是基本培养基 二是各种激素的浓度及相对比例 MS 培养基适合于大多数双 子叶植物 B5 和 N6 培养基适合与许多单子叶植物 特别是 N6 培养基对禾本科植物小麦 水稻等很有效 White 培养基适合于根的培养 实验内容与步骤实验内容与步骤 一 MS 大量元素母液的配制 一般将大量元素分别配制成 10 倍的母液 使用时再分别稀释 10 倍 依次分别称取 NH4NO3 16 5g KNO3 19 0g KH2PO4 1 70g MgSO4 7H2O 3 7g CaCl2 2H2O 4 4g 共配成 1L 的母液 倒入 1L 试剂瓶中 存放于冰箱中 二 MS 微量元素母液的配制 一般将微量元素配制成 100 倍母液 依次称取 KI 0 083g Na2MoO4 2H2O 0 025g H3BO3 0 62g CuSO4 5H2O 0 0025g MnSO4 H2O 1 69g CoCl2 6H2O 0 0025g ZnSO4 7H2O 0 86g 配成 1L 母液 倒入 1L 试剂瓶中 存放于冰箱中 CuSO4 5H2O 和 CoCl2 6H2O 由于称取量很小 如果天平精确度没有达到万分之一 可先 配成调整液 分别称取 CuSO4 5H2O 0 05g CoCl2 6H2O 0 05g 各自配成 100ml 的调整液 然后取 5ml 就还有 0 0025g 的量 三 MS 有机质母液的配制 一般配制成 100 倍 MS 有机母液 依次称取 肌醇 10g 盐酸硫胺素 VB1 0 01g 烟酸 0 05g 甘氨酸 0 2g 盐酸吡哆醇 VB6 0 05g 配成 1L 母液 倒入 1L 试剂瓶中 存放于冰箱中 四 MS 铁盐母液的配制 一般配制成 100 倍 MS 铁盐母液 依次称取 EDTA 二钠 3 73g 和 FeSO4 7H2O 2 78g 配成 1L 母液 倒入 1L 试剂瓶中 存放于冰箱中 所以 MS 母液有 5 种大量元素母液 加上 MS 微量元素母液 MS 有机母液和 MS 铁盐母 液 共 8 种母液 五 几种生长调节物质的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制 不能混合在一起 生长素类一般要先用少量 95 的酒精或 1 当量的 NaOH 溶解 细胞分裂素一般要先用 1 当量的盐酸溶解 然后再加蒸馏 水定容 一般取 100mg 配成 100ml 母液 母液的保存 一般将以上配制好的各种母液保存在 4 左右冰箱内 注意事项注意事项 1 称量要精确 2 配制母液时要注意药品溶解的先后顺序 以免发生化学反应 使的产生沉淀 附附 MS 培养基母液的配制与保存培养基母液的配制与保存 仪器与用具仪器与用具 1 仪器 各类天平 磁力搅拌器 冰箱等 2 用具 烧杯 容量瓶 量筒 试剂瓶 标签等 3 试剂 95 酒精 0 1 1 NaOH 0 1 1NHCl 配制 MS 培养基所需的各种无机物 有机 物 蒸馏水 方法步骤方法步骤 一 母液的配制 母液是欲配制培养基的浓缩液 一般配成比所需浓度高 10 100 倍的溶液 优点 1 保证各物质成分的准确性 2 便于配置时快速移取 3 便于低温保藏 1 MS 大量元素母液 10X 称 10 升量溶解在 1 升蒸馏水中 配 1 升培养基取母液 100ml 化学药品 1 升量 10 升量 NH4NO31650 mg L16 5g KNO31900 mg L19 0g CaCl2 2H2O 440 mg L4 4g MgSO4 7H2O 370 mg L3 7g KH2PO4170 mg L1 7g 2 MS 微量元素母液 100X 称 10 升量溶解在 100ml 蒸馏水中 配 1 升培养基取母液 10ml 化学药品 1 升量 10 升量 MnSO4 4H2O MnSO4 H2O 22 3 mg L 21 4 mg L 223mg ZnSO4 7H2O 8 6 mg L86mg CoCl2 6H2O 0 025mg L0 25mg CuSO4 5H2O 0 025 mg L0 25mg Na2MoO4 2H2O 0 25 mg L2 5mg KI0 83 mg L8 3 mg H3BO36 2 mg L62 mg 注意 CoCl2 6H2O 和 CuSO4 5H2O 可按 10 倍量 0 25 mgX10 2 5 mg 或 100 倍量 25 mg 称取后 定容于 100ml 水中 每次取 10ml 或 1ml 即含 0 25 mg 的量 加入 到母液中 3 MS 铁盐母液 100X 称 10 升量溶解在 100ml 蒸馏水中 配 1 升培养基取母液 10ml 化学药品 1 升量 10 升量 Na2 EDTA 37 3 mg L373 mg FeSO4 7H2O 27 8 mg L278 mg 注意配制时 应将两种成分分别溶解在少量蒸馏水中 其中 EDTA 盐较难完全溶解 可适 当加热 混合时 先取一种置容量瓶 烧杯 中 然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡 至 产生深黄色溶液 最后定容 保存在棕色试剂瓶中 4 MS 有机物母液 100X 称 10 升量溶解在 100ml 蒸馏水中 配 1 升培养基取母液 10ml 化学药品 1 升量 10 升量 烟酸 0 5 mg L5mg 盐酸吡哆素 VB6 0 5 mg L5mg 盐酸硫胺素 VB1 肌醇 100 mg L1 g 甘氨酸 2 mg L20mg 5 生长调节剂 单独配制 浓度为 1 5 mg ml 书中为 0 5 1mg ml 一般配成 4 mg ml 配制培养基母液时注意事项 一些离子易发生沉淀 可先用少量蒸馏水溶解 在按配方顺序依次混合 配制母液时必须用蒸馏水或重蒸馏水 药品应用化学纯或分析纯 溶解生长素时 可用少量 0 5 1N 的 NaOH 或 95 酒精溶解 溶解分裂素类用 0 5 1N 的 HCl 加热溶解 二 母液的保存 1 装瓶 将配制好的母液分别装入试剂瓶中 贴好标签 注明各培养基母液的名称 浓缩 倍数 日期 注意将易分解 氧化的溶液 放入棕色瓶中保存 2 贮藏 4 冰箱 附 组织培养室操作程序附 组织培养室操作程序 一 生产环境 1 工作人员进入组培室必须穿工作服 包括更换拖鞋 穿白大褂 接种人员还要带帽 带 口罩 2 所有人员在组培室内不准高声喧哗 打闹 3 工作期间 各生产房间要关闭房门 尤其是接种间 工作人员出入要随手关门 4 各种生产用品要安固定的位置排放整齐 不可乱拿乱放 5 工作过程中所产生的垃圾要及时清理 尤其是接种间 其内垃圾停留时间不得超过 4 小 时 二 接种程序 1 准备工作 接种人员在正式接种之前要做好准备工作 包括准备酒精灯 新洁尔 灭 灭菌用脱脂棉以及准备接种工具 分取培养基 接种用苗和工作台灭菌等 酒精灯用工业酒精作燃料 而非 75 酒精 工作台上用的新洁尔灭浓度是 0 1 而非 0 01 工作台灭菌包括两步 一是上台前用紫外灯照射 30 分钟 二是正式接种前 再用新洁尔灭仔细擦一遍 培养皿的取放 从布包里取培养皿时 一定要注意 手不能接触培养皿的边 沿 同时要尽可能减少与培养皿的接触面 一般规定只能用双手的拇指和食指取 放 接种工具灭菌也分两步 一是用灭菌布包裹好 在高压锅里灭一次 这一步 由灭菌人员负责完成 二是在工作台上 从布包里取出后 先用酒精擦拭一下 再 放在酒精灯火焰上灼烤一遍 其要求是工具的每一点在火焰上灼烤时间不得少于 5 秒钟 在工具灭菌之前 工作人员的手部 包括手腕 都要用酒精仔细擦拭一遍 2 接 转 苗 包括取苗 切苗和接苗三步 取苗 先解开培养瓶的瓶盖 封口膜 如果不能一次取出其内的全部材料 要先把封口膜 瓶盖 口对者风源放在酒精灯的左前方 然后把瓶口在酒精灯上烤 7 10 秒 正式取苗时 瓶口不要斜向外 一次取苗不可太多 以免风干 切苗 培养皿放在离风窗 10 20 厘米处 不可太往外 镊子和手术刀都不可太 热 最好是凉的 且在操作过程中 刀和镊都要培养皿斜上方操作 不可在其正上 方操作 在切苗过程中产生的垃圾可堆放在培养皿内的一侧位置上 若非迫不得已 不可弄到培养皿外 接苗 培养瓶盖 或封口膜 的放置方法和及瓶口灼烤方法与取苗时的相同 烤完瓶口后 要先倒掉瓶内多余的水分 然后在接苗 接苗时 镊子最好不要与瓶 口接触 一瓶内一般接 5 6 棵苗 不要放得太多 组培苗在瓶内要排放均匀 整齐 美观 封口 记录 封口膜要及时捆绑 其松紧度以用手转不动为准 下台前要把品 种代号 培养基类型 个人编号以及接种日期标示到瓶上 离开之前还要把工作台 收拾干净 把接种过程中产生的垃圾清理掉 台上的物品也要摆放整齐 三组培苗的管理 1 瓶苗要整齐的摆放在自己的组培架上 不可乱放 2 接种人员每天都要统计自己的接种数量 包括转前瓶数和转后瓶数 3 值日人员要定时开灯 关灯 保证组培苗有足够的光照时间 但也不可过长 以每天 14 小时左右为宜 四 接种用具的清洗 1 洗刷培养瓶 培养皿 第一步 把培养瓶培养皿放入洗洁净溶液里 先用毛刷 清洗内部