蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤

蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法 这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法 待测 蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化 另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多 克隆抗体进行识别 关键词 关键词 印迹蛋白质步骤蛋白质印迹分析蛋白质印迹 Westernblottingimmunoblotting 免疫印迹法蛋白质印 迹法 实验原理实验原理 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法 这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学 技术方法 待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化 另外这项技术的应用需 要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别 如图所示 可溶性抗原 也就是待测蛋白首先要根据其性质 如分子量 分子大小 电荷 以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离 通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二 氟乙烯膜上 利用抗体 一抗 与抗原发生特异性结合的原理 以抗体作为探针钓取目的 蛋白 值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白 如牛血清白蛋白对膜进行 封 阻 而防止抗体与膜的非特异性结合 经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上 我们把这个过程称 为电泳印迹 常用的两种电转移方法分别为 1 半干法 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间 通电时间为 10 分钟 30 分钟 2 湿法 凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中 转移时间可从 45 分钟延长到过夜进 行 由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料 因此我们在这里只描述湿 法的基本操作过程 对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体 该抗体往往是购买的成品 已经 被结合或标记了特定的试剂 如辣根过氧化物酶 这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化 的一个比色反应 该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上 容易鉴别 因此可通 过对二抗的识别而识别一抗 进而判断出目标蛋白所在的位置 其他的识别系统包括碱性 磷酸酶系统和 125I 标记系统 1 实验器材实验器材 SDS PAGE 实验相关材料 电转移装置 供电设备 PVDF 膜 Millipore Immobion P I PVH 000 10 Whatman 3MM 纸 其他工具 镊子 海绵垫 剪子 手套 小塑料或 玻璃容器 浅盘 易生物仪器库 易生物试剂库 2 实验试剂实验试剂 10 x 转移缓冲溶液 1L 30 3g Trizma base 0 25M 144 g 甘氨酸 1 92M 加蒸馏 水至 1L 此时 pH 约为 8 3 不必调整 1x 转移缓冲溶液 2L 在 1 4L 蒸馏水中加入 400 ml 甲醇及 200 ml10 x 转移缓冲 溶液 TBS 缓冲溶液 将 1 22g Tris 10 mM 和 8 78g NaCl 150 mM 加入到 1L 蒸馏水中 用 HCl 调节 pH 至 7 5 TTBS buffer 在 1L TBS 缓冲溶液中加入 0 5ml Tween 20 0 05 一抗 兔抗待测蛋白抗体 多克隆抗体 6 二抗 辣根过氧化物酶标记羊抗兔 3 封阻缓冲溶液 0 5L 牛血清白蛋白 15mg 加入 TBS 缓冲溶液并定容至 0 5L 过滤 在 4 C 保存以防止细菌污染 0 5 封阻缓冲溶液 0 5L 牛血清白蛋白 2 5mg 加入 TTBS 缓冲溶液并定容至 0 5L 过滤 在 4 C 保存以防止细菌污染 显影试剂 1ml 氯萘溶液 30mg ml 甲醇配置 加入 10 ml 甲醇 加入 TBS 缓冲溶液 至 50 ml 加入 30 ul 30 H2O2 染色液 1g 氨基黑 18B 0 1 250ml 异丙醇 25 及 100ml 乙酸 10 用蒸馏水定 容至 1L 脱色液 将 350ml 异丙醇 35 和 20 ml 乙酸 2 用蒸馏水定容至 1L 实验操作实验操作 蛋白质的分离蛋白质的分离 根据目的蛋白的性质 利用电泳方法将其进行分离 为提高电转移的效率 通常采用 SDS PAGE 技术 分离实验结束后 首先将样品墙的上边缘用小刀去除 然后在胶板的右上角切一个小口以 便定位 小心放入转移缓冲溶液中待用 电转移电转移 准备 PVDF 膜 根据胶的大小剪出一片 PVDF 膜 膜的大小应略微小于胶的大小 将膜置于甲醇中浸泡 1 分钟 再移至转移缓冲溶液中待用 制作胶膜夹心 在一浅盘中打开转移盒 将一个预先用转移缓冲溶液浸泡过的海绵垫放在转移盒的黑色筛 孔板上 在海绵垫的上方放置经转移缓冲溶液浸湿的 3MM 纸 小心地将胶板放在 3MM 纸 上 并注意排除气泡 将 PVDF 膜放在胶的上方同时注意排除气泡 再在膜的上方放上一 张同样用转移缓冲溶液浸湿过的 3MM 纸并赶出气泡 放置另一张浸泡过的海绵垫 关闭 转移盒 将转移盒按照正确的方向放入转移槽中 转移盒的黑色筛孔板贴近转移槽的黑色 端 转移盒的白色筛孔板贴近转移槽的白色端 填满转移缓冲溶液同时防止出现气泡 电转移 连接电源 在 4 C 条件下维持恒压 100v 1 小时 免疫检测免疫检测 膜染色 断开电源 将转移盒从转移槽中移出 将转移盒的各个部分分开 用镊子将 PVDF 膜小心 放入一个干净的容器中 用 TBS 缓冲溶液进行短暂清洗 从膜上剪下一条宽约 5mm 的膜 放入另一个干净的容器中 将这条膜在染色液中浸泡 1 分钟 然后在脱色液中脱色 30 分 钟 确定蛋白质已经转移到 PVDF 膜上 膜的封闭和清洗 对于没有进行染色的膜 首先倒出 TBS 缓冲溶液 加入 3 封闭缓冲溶液 轻轻摇动至少 1 小时 倒掉 3 封闭缓冲溶液 并用 TBS 缓冲溶液清洗 3 次 每次 5 分钟 一抗 倒掉 TBS 缓冲溶液 加入 10 ml 0 5 封闭缓冲溶液及适量的一抗 轻轻摇动 1 小时以上 从容器中倒出一抗及封闭缓冲溶液 用 TTBS 缓冲溶液清洗两次 每次 10 分钟 二抗 倒出 TTBS 缓冲溶液 加入 5 ml 0 5 封闭缓冲溶液及适量的二抗 轻轻摇动 30 分钟 倒出二抗及封闭缓冲溶液 用 TTBS 缓冲溶液清洗两次 每次