体外分析-核医学-2016

第六章 体外分析,深圳大学第一附属医院 核医学科 申群喜,待测物质浓度与检测手段,临床化学分析,pg/L,ng/L,mg/L,mg/L,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Allergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,常量,微量,超微量,定 义：,利用放射分析方法或其派生的相关技术，测定生物样品中微量生物活性物质含量检测：激素 肿瘤标志物 药物浓度 受体,分 类：,Click to add title in here,4,2,3,体外分析技术,体外放射分析,体外非放射分析,放射性竞争结合分析,放射性非竞争结合分析,放射免疫分析*,(IRMA),免疫放射分析*,酶免疫分析,(EIA),化学发光免疫分析,(CLIA),荧光免疫分析,(FIA),(RIA),胶体金标记分析 (CGIA),第一节 放射免疫分析 Radioimmunoassay, RIA,Ag,Ab,+,Ag-Ab,环 境 因 素： 离子强度 生理盐水或缓冲液 酸 碱 度 pH6-pH9, pH7左右 温 度 15-40 ,37 最适,抗原抗体特异性结合反应,一. RIA基本原理*,讨论简单化，假定的“理想模式”： 抗原和标记抗原对抗体具有完全相同 的免疫活性2. 抗体只有一种抗原结合位置 1+1=1反应3. 反应符合质量作用定律 Ag+Ab AgAb,一. RIA基本原理*,V1,V2,AgAb,Ag Ab,K=,一. RIA基本原理*,（一）竞争抑制免疫结合反应：体外条件下 过量的放射性标记抗原（*Ag）与非标记抗原（即待测抗原，Ag）同时与限量的特异性抗体（Ab）进行竞争抑制免疫结合反应 （三种成份）,Ag-Ab + Ag,*Ag,Ab,+,*Ag-Ab,(B),(F),+ *Ag（过量部分）,*Ag:标记抗原 Ag:非标记抗原 Ab:特异性抗体*Ag-Ab:标记的抗原-抗体复合物 Ag-Ab:非标记的抗原-抗体复合物,一. RIA基本原理*,一. RIA基本原理*,RIA原理示意图,一. RIA基本原理*,（二） 剂量反应曲线/标准曲线： 定量基础： *Ag-Ab的量（因变量）与Ag的量（自变量）之间存在竞争性抑制数量关系函数关系：二次函数关系 用标准竞争抑制曲线（简称标准曲线）替代,一. RIA的基本原理*,标准曲线的制备,一. RIA基本原理*,标准曲线,一. RIA基本原理*,标准曲线(CG),（三）未知样品的检测:同等条件下 待测抗原+过量的标记抗原+限量的特异性抗体 温育 分离B和F 测量放射性活度 查标准曲线求出浓度,一. RIA基本原理*,一. RIA基本原理*,未知样品的检测,Ag,未知样品的检测,一. RIA基本原理*,完整的试剂盒（商品化）包括： 1. 抗体 2. 标记抗原 3. 标准抗原 4. 质控品 5. 沉淀剂,二. RIA基本试剂,（一）抗体（Antibody,Ab） IgG类 “三高”: 1 亲和力 以亲和常数K表示 2 特异性 以交叉反应率表示 3 滴度 以抗体最适稀释度表示,二. RIA基本试剂,AgAb,Ag Ab,K=,抗体的制备： 多克隆抗体 免疫动物所得抗血清 单克隆抗体 杂交瘤技术所得抗体,二. RIA基本试剂,（二）标记抗原（* Antigen,*Ag）抗原分子中一个或数个原子被放射性核素所取代 标记的放射性核素有3H 14C 125I等 125I 比活度高 半衰期合适（60天） 利用酪氨酸的“嗜碘性”标记,二. RIA基本试剂,（二）标记抗原（* Antigen,*Ag） 要求： 1. 同质性 2. 高放射性比活度（kBq/ug) 3. 放射化学纯度 95% 4. 免疫活性高,二. RIA基本试剂,（三）标准抗原（标准品）高浓度的纯品物质化学标准品 结构清楚 物理化学方法可测定 质量单位(ng/L)生物标准品 不能用物理化学方法测定 采用与 被测物质相似分子形式的物质 生物单位(mIU/L)要求：1. 均质性 2. 纯度高 3. 定量准确,二. RIA基本试剂,（四）待测样品血浆 血清 体液 组织液要求：符合放射性检测方法的要求 去除可能存在的干扰成份,二. RIA基本试剂,（五）检测仪器计数仪：125I 检测射线闪烁计数器：3H或者14C 检测射线,二. RIA基本试剂,（一）理想的分离方法： 1. 完全分离 2. 不影响反应的平衡 3. 不受外界或其它试剂的干扰 4. 操作简便 重复性好 5. 来源方便 价格低廉,三. RIA分离方法,（二）常用分离方法的比较：分离方法 优 点 缺 点,三. RIA分离方法,分离快 适用于任何温育体积 沉淀易于观察 便宜组分介质及损伤组分的分析 新方法的研究和建立分离快，适用于任何温育体积，蛋白质含量较低的分离介质蛋白质浓度影响小，通用，特异性高，分离完全分离快，简易，适用于大批样品的检测,条件不易掌握，分离不完全，对蛋白质敏感点样量少，不能处理大量样品，测定体积受限，特殊设备对蛋白质浓度、离子强度及PH都敏感，沉淀不稳定二抗价格高、流程长，二次温育可能建立新的平衡依赖商品供应，抗体用量大，价高，固相抗体贮存不稳定,活性炭吸附法电泳法沉淀法双抗体法固相法,（一）误差的种类： 1. 系统误差 确定的原因 :仪器设备 试剂质量 标准曲线拟合方式等 结果：倾向性偏高或偏低 以“准确度”(accuracy)表示 2. 随机误差 难以确定的原因：放射性测量的统计 涨落 探测仪器不稳定等 结果：双向性 以“精密度”(percision)表示,四. RIA质量控制,（二）精密度与准确度的区别与联系,四. RIA质量控制,甲 乙 丙 丁,甲：即准确又 乙：不准确， 丙：尚准确， 丁：即不准确 精密 但精密 但不精密 也不精密,1 零标准管结合率（B0%） 30%-50%2 非特异性结合率（NSB%）5%-10%3 室内质控图 制作及质控规则,四. RIA质量控制,（三）室内质量控制,（四）室间质量控制,第二节 免疫放射分析 Immunoradiometric assay, IRMA,一. IRMA基本原理*,（一）非竞争性免疫结合反应：体外条件下 过量的放射性标记抗体（*Ab）与非标记抗原（Ag）进行非竞争性免疫结合反应 （二种试剂 ）,*Ab,+,Ag-*Ab + *Ab,Ag,（B）,（F）,（二） 剂量反应曲线/标准曲线： 定量基础： Ag- * Ab的量（因变量）与Ag的量（自变量）之间存在正相关的函数关系 用标准结合曲线（简称标准曲线）替代,一. IRMA基本原理*,标准曲线的制备,一. IRMA基本原理*,IRMA标准曲线的制备,一. IRMA基本原理*,RIA标准曲线的制备,B%,标准曲线,一. IRMA基本原理*,B%,B%,IRMA的标准曲线,RIA的标准曲线,一. IRMA基本原理*,二. IRMA常用方法,双抗夹心法 (double antibody sandwich method)2.标记第三抗体法(labeled third antibody method)3.双标记抗体法(double labeled antibody method),优点：l 反应动力学：非竞争性 且抗体过量 容易达到平衡 温度变化对结果影响不大。l 灵敏度：比RIA高出10100倍。l 加样误差少：加样误差主要来自抗原一个环节缺点：l需要特殊的分离方法。l对半抗原不适应l要大量的*Ab，昂贵,三. IRMA优缺点,四. IRMA与RIA主要区别*,第三节 非放射免疫分析技术,1 酶标记免疫分析技术2 化学发光免疫分析技术 3 时间分辨荧光免疫分析技术4 胶体金标记分析技术,一 酶标记免疫分析技术（enzyme immumoassay,EIA) 酶分子代替放射性核素 标记抗原或抗体的免疫分析的技术 结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性。常见方法为ELISA。 常用的酶为辣根过氧化物酶 底物是四甲基联苯胺 (TMB) ，反应后显黄色。,二 化学发光免疫分析技术(CLIA) 以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。 1 化学发光免疫分析 吖啶酯2 化学发光酶免疫分析 金刚烷3 电化学发光免疫测定 三联吡啶钌,三 时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）,采用稀土元素标记抗体，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得稀土元素的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。,四 胶体金标记分析技术技术（colloidal-gold immunoassay，CGIA）,采用胶体金为标记物，利用氯金酸（HAuCl4)在还原剂的作用下，形成红色的胶体状态。,问题：,放射免疫分析反应物有几种 ？放射免疫分析抗原通常用什么标记?免疫放射分析反应物有几种？,小结,掌握: 1.放射免疫分