实验十-50L发酵罐的使用——发酵过程与控制

实验十实验十 50L 发酵罐的使用发酵罐的使用 发酵过程与控制发酵过程与控制 生物工程生物工程 132 邓信任邓信任 1 实验目的实验目的 认识全自动生物反应器的安装和准备 反应后的拆卸和清洗等 了解 pH 电极和溶氧 电极 DO 的结构及基本原理 掌握 pH 电极和溶氧电极的校正方法 认识发酵罐培养基 的灭菌 认识反应器在位高压灭菌的方法和规程 学会反应器培养液灭菌过程中的升温 保压 降温和培养温度的设定等操作 掌握接种的方法及操作 确保发酵液无杂菌污染 掌握 pH 调节剂 消泡剂及补料的连接方法 学会从反应器中定时取出样液的方法 学会 如何进行参数控制并掌握正确使用先进反应器发酵生产的方法 从而可对中试级中试以上 的发酵生产研究有一个初步的概念和感性认识 2 实验原理实验原理 1 安装和拆卸安装和拆卸 反应器为碟形 上盖可以自动起降 与罐体通过橡皮垫圈和螺栓密封 盖上设有搅拌 电机 搅拌轴 机械密封及多个接口 接种口 空气进口 尾气出口 各种检测仪表的插 孔 消泡剂和酸碱液注入口 补料口 备用口 压力表等 罐体设有夹套层 用以加热或 冷却 罐内有搅拌桨叶 挡板 空气分布器 中部侧面装有温度传感器 溶氧电极和 pH 电极插口及取样口 与罐体连接的部分布有无菌空气系统 并配备一台自动调控装置 整 个装置处于工作状态时 必须保持无菌 而操作结束后 必须移走培养液并清洗罐体等 2 pH 电极的校正电极的校正 待校正的 pH 电极是由氯化银参比电极和玻璃电极组合 在一起的复合玻璃电极 复合电极的内层玻璃管与玻璃球泡 相通 内充以恒定 pH 的标准缓冲溶液 从中引出氯化银电 极导线 组成玻璃电极 即指示电极 在外层玻璃管引入 银丝 其表面覆盖一层氯化银薄膜 从上部扩大部分边上的 注液口加入饱和氯化钾溶液 即形成氯化银电极 在外玻璃 管的下部开有一小口 装有多孔陶瓷芯 使氯化钾溶液可稍 往外溶液渗漏 即所谓的液络部 复合电极的基本性能参数 有电极转换系数 也称 Nernst 斜率 电极零电位 电极内 阻 参比电阻 电极响应时间 耐高温冲击的次数等 它们 都有一定的要求和测试方法 新使用的电极或已经发酵运行 一段时间的电极 其性能参数会发生变化 对某些性能参数 要进行测定 决定是否可投入使用 3 溶氧电极的校正溶氧电极的校正 电解型电极是由一个阴极 贵重金属如铂或金 一个 阳极 Ag AgCl 和一种电解质 如中性 NaCl 溶液 组成的 图 1 在某一荣溶氧浓度一定的溶液系统中 通过电极 之间 0 6 0 8V 的电压 使溶解氧在阴极上被还原 从电极的 电流 电压极谱图 图 2a 中可以看出 OA 为极谱残余电流 A 点为氧的分解电压 当 外加电压大于分解电压 A 时 电极输出电流 I 随着外加电压而增加 当达到 B 点后 电极 电流就不再随着外加电压增大而增加 即电极电压进入恒定区 此时称为饱和电流或扩散 电流 当外加电压继续增至 C 点时 电极输出电流迅速增加 这是由水被还原成氧造成的 从图 2b 中也可以看出 饱和电流与溶氧浓度呈正比关系 因此 只要把外加电压固定在电 流电压图中的平坦部分 电极输出电流就可以校正测量溶解氧 这个固定电压常选为 0 6 0 8V 反应式为 阴极 O2 2H20 2e H2O 2OH H2O2 2e 2OH 阳极 Ag Cl AgCl e 总反应 4Ag O2 2H2O 4Cl 4AgCl 4OH 用 NaCl 或 KCl 作为电解质 在使用过程中电解质被消耗 必须在一段时间后补充 4 反应器培养液的灭菌与接种培养反应器培养液的灭菌与接种培养 生物反应器的灭菌时采用夹套层蒸汽预热后直接或间接通入饱和蒸汽灭菌的方式进行 的 可将反应器内培养液的温度升至 121 以达到灭菌的效果 灭菌后的培养基冷却至 培养温度后 即可接种培养 接种时 严格按照无菌操作进行 避免杂菌污染 5 补料 取样补料 取样 生物反应器的补料 酸碱 消泡剂及其他营养液 可通过蠕动泵进行 可自动也可手 动 取样时了解发酵过程的重要手段 取样时 严格按照无菌操作进行 避免杂菌污染 3 实验步骤 1 准备工作准备工作 首先拧下螺栓 启动自动升降机 打开上盖 检查培养罐内部是否清洗干净 插入校 正完毕的 pH 电极和氧电极与罐侧面相关位置 并与控制连接 加入配置好的培养液 加 盖并对称地拧紧螺母 直至上盖被密封固定 安装安全阀 泡沫传感器 观察灯 压力计 取样管及空气过滤器等 剩余的孔洞需用硅胶塞拧紧备用 使用完毕后拆卸时与以上步骤 相反 并彻底清洗罐体及零件 2 pH 校正校正 此步骤必须于发酵罐灭菌前先校正 再将电极插入罐内 1 将电极置入零点标准液里 7 00 看 pH 稳定后按 7 00 ZERO 下方 此时 pH 显示值 PV 会显示 7 00 2 将电极用纯水洗涤 置入标准液里 4 00 看 pH 稳定后按 4 00 键 SPAN 下 方 此时 pH 显示值 PV 会显示 4 00 3 将电极置入标准液里 7 00 看 pH 之量测值是否显示正确 4 如尚有误差 请重复 1 2 步骤 注意 用于发酵过程中经取样量测 如发现与显示值有偏差 请调整使显示值正确 此数值乃将取样量测值减显示值之误差量输入 3 DO 校正校正 此步骤必须于发酵罐灭菌后罐内温度稳定时才能进行 1 将电极讯号线接头拆开 看 DO 之量测值稳定后按 0 键 ZERO 下方 DO 显 示值会显示 0 0 2 将电极讯号线接头街上 槽内通气至饱和 看 DO 之量测值稳定后按 100 键 SPAN 下方 此时 DO 显示值会显示 99 9 3 将电极讯号线接头拆开 看 DO 量测值是否显示正确 4 如尚有误差 请重复 1 2 步骤 注意 用于发酵过程中经取样量测 如发现与显示值有偏差 请调整使显示值正确 此数值乃将取样量测值减显示值之误差量输入 4 反应器的灭菌和发酵反应器的灭菌和发酵 1 灭菌 此系统在灭菌状态前需将灭菌的条件作业准备妥当 包括以下几个方面 1 罐体洗干净后将顶板降下并锁紧 切记此步骤完成后方可将控制启动 2 再次确定顶板盖是否已完全紧密 各接口是否已安装上并锁紧 空气过滤器是 否已安装或确定可用 3 pH 先行校正完成并插入槽内 DO 电极插入槽内 DO 灭完菌后温度至发酵温 度后再校正 4 将培养基装入罐内 并确认容量足够高于各感测电极 5 加料液及管件是否已事先灭菌准备完成 6 顶板不用的接口是否已拴紧 7 检查电极孔及取样口是否已定位锁紧 各供应源是否已准备好 空气 冷却水 蒸汽 8 完成上述所有步骤后即可开始灭菌 确定所设定灭菌条件正确后 将搅拌 温 度 流量控制开关启动 开启灭菌开关开始灭菌 灭菌完成后系统会自动冷却 待冷却程 序完成后系统会警报警示 之后将系统切至发酵即可开始发酵 2 接种与培养 通入反应器的空气从空压机经空气过滤器而成无菌空气 再由空气分布管送入灭过菌 的培养罐内 在控制台上 设定所需的搅拌转速 发酵温度 pH 并将空气流量计的流量 调至确定值 DO 校正 将事先培养好的培养液 在三角瓶中进行摇床培养 处于对数生长期的细胞 以无菌 操作方式倒入已灭菌的 带有插在保险管套筒内的注射针及软管的三角瓶内 或直接倒入 三角瓶种子 由接种口接入罐内 接种时 要在接种口的隔膜周围放上浸有乙醇的棉花或 用 1 3ml 乙醇覆盖 点燃 以产生上升的气流来防止杂菌污染 接种塞从无菌筒内取出 然后将接种针穿过火焰和隔膜 慢慢插入中心部位 拧紧连接螺帽 直至插入部分固定 接种量大体上是培养液的百分之几 5 补料 取样补料 取样 当调节 pH 和泡沫时 可将酸液或碱液及消泡剂装入三角瓶 灭菌后 分别经蠕动泵 与反应器连接 补料与之相同 这样 通过控制台的自动控制 就可以自动地连接流加 为了了解培养过程中反应物的变化 必须定时进行取样 取样前 要先 Udine 取样口 进行灭菌后再取样 取样时关闭排气口 使罐内处于正压状态 打开取样口 培养液即可 自动流出 但是 在下次取样时 必须注意将残夜放干净后再取样 四 思考题 1 为什么 pH 电极在生物反应之前要进行校正 答 因为要对 PH 电极的零电位和斜率标定后测量才准确 校正其电极 保持其反 应灵 敏度 之后的测量更加准确 pH 电极使用一段时间后 不对称电位将会发生很大改 变 故必须定期校准 在下列情况下 必须重新校准 a 长期使用的电极基新换的电极 b 测量浓酸 pH 2 以后 或测量浓碱 pH 12 以后 c 测量含有氟化物的溶液 或较浓的有机溶液后 d 被测溶液温度与标准溶液温度 或室温 相差过大时 对新使用的电极或已经发酵运行一段时间的电极 其性能参数要发生变化 对某些性能 参数要进行测定 决定是否可投入使用 因为在经过使用后 标准缓冲液的浓度会发生变 化等 每使用过一次 标准缓冲液也会发生细微变化 因为缓冲液和发酵液在测试时 会 发生交换 缓冲液浓度 成分等会改变 因而 pH 指示不是真正的标准值 因而 pH 电 极在生物反应之前要进行矫正 通常选取 pH 4 pH 7 进行矫正 而首次使用前需要给其 进行电极通电 进行火化 2 在 pH 电极的校正操作过程中应注意哪些注意事项 答 1 认真地在发酵罐中安装好 PH 电极 安装过程时 切忌将电极薄膜碰撞到发罐 管壁等 2 根据发酵液的 pH 确定电极矫正的 pH 矫正 一般是 pH 4 pH 7 3 矫正前要确保标准液 如 pH 4 的标准液没有被污染 尽量混匀 4 在不同的标准液进行矫正前 先用纯水清洗一下 以免相互影响 5 pH 电极一般进行多次矫正 3 为什么在生物反应之前要对 DO 电极进行校正 是否每次反应都必须校正 为什么 答 因为在测量发酵液的溶氧量时 也会发生电解液和发酵液的进行交换等 这样会导 致电解液的变化 从而导致溶氧电极的测定也会出现误差 所以 在生物反应之前要对 Do 电极的矫正 每次反应都要进行矫正 因为溶氧电极在不同罐内测定有