SNP检测方法

单核苷酸多态性（SNP）,林壹明2011/5/9,主要内容,一、SNP概念、分类与特点二、SNP检测技术三、SNP研究现状四、SNP应用前景,SNP(single nucleotide polymophism) 即单核苷酸多态性，是指群体中变异频率大于1 %的单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性，包括转换、颠换、缺失和插入。但是比较常见的是转换和颠换，大约占80%。一般来说，一个 SNP 位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP在人基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。,SNP概念,SNP分类,根据在基因中的位置，SNP 可分为基因编码区SNP(coding SNP, cSNP)、基因内含子区SNP和基因调控区SNP(regulatory SNP, rSNP)。其中cSNP根据是否改变编码的氨基酸又可分为同义cSNP (synonymous cSNP)和非同义cSNP (non-synonymous cSNP)。,SNP的主要特征,（一）、密度高。SNPs 在人类基因组中的总数超过300万。（二）、遗传稳定性好。（三）、分布不均匀。非编码区的数目远远大于编码区的数目。（四）、具有代表性。（五）、分析易自动化。由于每个SNP 位点通常仅含两个等位基因双等位基因(biallele)，在检测时能通过一个简单的“+/”分析进行基因型分型，而无需分析片段的长度，因而易于自动化。,SNP检测技术,理想的检测SNPs的方法 发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs必须具备以下优点: (1) 适合自动化操作,简便、迅速; (2) 分析费用低,特殊试剂用量少; (3) 反应要严紧,即使不纯的样品也可得到可靠的结果; (4) 数据分析简单,易于自动化分析; (5) 反应的通量要大而灵活,一天可以完成几百，甚至到上百万个样品的检测与分析。,现在常用的SNP检测技术：1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.电泳法4.直接测序法 另外还包括化学法（如高锰酸钾法），物理法（例如基质辅助的激光吸附离子化飞行时间质谱分析）等。,1.基于杂交的方法,原理: 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时，在完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。（Tm差异越大，检测的特异性就越好）分为： (1）利用Tm； (2）杂交+荧光探针。,(1)利用Tm,固定温度 等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、 PNA、 LNAs 等 动态的加热过程 动态等位基因特异杂交 (dynamic allele-specific hybridization, DASH),核酸肽探针（Peptide nucleic acids，PNA),其骨架是肽键特点：1、与靶分子高特异性地结合（3个方面的影响）；2、链挤入 （形成三链复合结构）（表达调控以及反义治疗方面）；3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感（体外应用）。,与靶分子高特异性地结合,Tm值高受盐浓度影响小（低盐浓度的体系）Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度） 所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排除。,LNA(locked nucleic acids),其结构是在RNA分子的2羟基和核糖环的4碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。特点： 1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合（构象更利于杂交的稳定） 2.匹配和不匹配之间的Tm增加,DASH(dynamic allele-specific hybridization）,（2）杂交+荧光探针,分子信标（双分子间杂交）,分子信标（Molecular beacons）,是在样品PCR过程中因和样品DNA 杂交后而使自身荧光构象改变从而实现SNP的检测。,分子信标是一种新型的发夹结构的寡核苷酸探针,2.基于酶的方法,1）DNA聚合酶2）连接酶3）限制性内切酶4）外切酶FEN5）RNase H,DNA聚合酶法,Taqman法单碱基延伸法焦磷酸测序法,此类方法是根据PCR 过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对SNP位点的检测,是基于以下两点: (1) 错配出现在引物中部时致使稳定性降低,在严格杂交条件下将不能退火; (2) 错配出现在引物3端时,引物将不能延伸。,因此针对不同等位基因设计平行引物,上游引物的3端和多态性位点互补,这样只有和引物完全互补的序列才能得到扩增,不同的等位基因依赖于所使用的不同引物分别得以扩增。产生的PCR 产物可以通过凝胶电泳或实时的荧光测定来实现对其的分析。,Taqman 法,优点：闭管进行， 减少污染。缺点：淬灭难以彻底， 本底较高。,单碱基延伸法（single base extension),基本步骤,1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA。2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)。3.引物延伸。4.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等）。,焦磷酸测序法(Pyrosequencing ),原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。,基本步骤,1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与酶和底物孵育。2.四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。3.一系列的酶学反应，发出可见光信号。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。4. ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。5.然后加入下一种dNTP。,3.电泳法,电泳法：就是利用电泳的方法对含有SNP的寡核苷酸链进行分离检测的技术。SSCP单链构象多态性（single strand conformation polymorphism）DGGETGGE变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis）,SSCP单链构象多态性（single strand conformation polymorphism）,原理：非变性条件下，单链DNA(singlestranded DNA，简称ssDNA)链内碱基发生卷曲而形成一个较稳定的空间构象，DNA序列的改变会使卷曲DNA分子构象发生变化，所以，有序列差异的DNA分子通过非变性凝胶时，由于构象不同，所受到的阻力大小也就不同，结果是涌动速度的不同，从而达到分离的目的。1. 内切酶降解DNA样品，然后做变性处理；2. 在非变性PAGE电泳上进行电泳。 但是，该方法的分辨率较差。,4. 直接测序法,直接测序法：该方法是将获得的DNA序列直接进行测序，然后与标准的序列进行比对，对序列中的SNP进行检测的方法。 该方法检测能力一般，而且由于成本比较高，不适合大规模筛查SNP。,SNP研究现状,一、 SNPs 数据库；二 、基于SNPs 研究的单倍型图谱计划(Haplotype Map Project）；三、SNPs 在复杂疾病研究中的现状。,SNPs 数据库,SNPs 是伴随着HGP 发展起来的，HGP 的迅速发展为SNPs 的应用提供了可行性，而鉴定人类DNA 序列的差异，寻找基因组中更多的SNPs 是HGP 下一步的重要目标。 目前，不同基因的详细SNP 图谱逐渐被完成。,常用的SNPs数据库,NCBI dbSNP是主要的SNPs数据库(/SNP)，由美国国立生物技术信息中心(NCBI)和国家人类基因组研究所(NHGRI)共同组建；TSC 数据库()，由SNP 国际协会建立；JSNP 数据库(http:/snp.ims.utokyo.ac.jp/index.html)，始建于2000 年4 月，是由人类基因组中心(HGC)、医学科学研究院(IMS)、东京大学、日本科技公司(JST)合办。,基于SNPs 研究的单倍型图谱计划,寻找标记SNPs 的国际遗传变异图谱计划，即国际单倍型图谱计划(Haplotype Map Project)已于2002 年10 月正式启动，2003 年中国承担了“国际单倍型图谱计划”10% 的任务。HapMap 计划的目标在于，确定人类基因组中普通模式的DNA 序列变异，通过测定序列变异特征、变异频率、它们之间的关联，绘出人类基因组的单倍型块，以及不同单倍型块的标记SNPs 。,SNPs 在复杂疾病研究中的现状,SNPs 由于其分布广、密度高而被期望在诸如癌 症、糖尿病、高血压、忧郁症和哮喘等复杂疾病 的研究中起重要作用。 上述疾病是多个遗传变异位点与环境因子共同作用的结果，由于发病原因复杂，涉及的基因数量多，已成为国际上疾病基因组学研究的重点，我国国家基因组南方中心已对鼻咽癌等多种疾病展开深入研究，建立了家系收集网络，取得了一定进展。,国内研究者在单个基因的SNPs与疾病相关性方面进行了大量研究。如应用实时荧光技术分析N-乙酰基转移酶基因多态性与肝癌易感性的关系，结果表明，携带N-乙酰基转移酶基因慢乙酰化基因型的吸烟者可能是肝癌的高危人群。目前已有实验将SNPs 应用于肿瘤预后及易感性的判断。如日本学者发现了H