艾滋病班潘晶

济南市艾滋病筛查实验室检测技术培训,济南市CDC 潘晶2014.10,目 录,1.艾滋病筛查实验室较常使用的实验方法的注意事项2.实验室的质量控制3.艾滋病职业暴露的处理4.实验室生物安全5.月报管理6.实验室督导考核总结,常用的实验方法-酶联免疫法,是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。标记免疫技术一般分为两类。 免疫组化技术 酶联免疫法,ELISA基本原理,免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法。特点是具有高度的特异性和敏感性。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体 固相的抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体 酶作用的底物,目前主要使用双抗原夹心法最常用的方法，操作步骤如下：将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原（在商品化的试剂盒中，已经完成此步骤）加标本形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去未结合的物质加酶标志物，彻底洗涤未结合的酶标志物加底物，根据颜色反应的程度进行该抗体的定性判断加终止液，在限定时间内放入酶标仪内读数,ELISA的成品试剂盒中包含以下各组分： (1)已包被抗原或抗体的固相载体(96孔板) (2)酶标记的抗原或抗体(酶结合物) (3)酶的底物（缓冲液和底物液或称A/B液） (4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中) (5)有些试剂盒中还有标本的稀释液 (6)洗涤液（基本为通用的浓缩磷酸盐溶液） (7)酶反应终止液（一般为弱硫酸液）,ELISA试剂盒的组成,ELISA方法模式图,ELISA检测需注意的问题：操作环境,在实验室的污染区内完成各项实验。必须在生物安全柜内进行。实验人员必须穿着防护服，带口罩、帽子、手套等。,实验室的环境温度对ELISA实验的结果准确性有很大的影响一般室温条件为：18-25水浴箱/孵育箱的温度应严格控制在：37 实验室必须放置温湿度剂水浴箱/孵育箱内放置水银温度计，不可放置湿盘,ELISA检测需注意的问题：环境温度,仪器的校准鉴定是确保整个实验顺利进行的重要条件之一，是必须具备的。仪器鉴定要提前进行，以防止仪器使用中出现鉴定过期现象。仪器的鉴定管理最好有专人负责管理。仪器包括：微量移液器、酶标仪、洗板机、水浴箱。,ELISA检测需注意的问题：仪器的校准,酶标仪是决定整个实验室准确性最关键的设备，因此每年都需要进行仪器鉴定。在日常工作中，最少一个月要进行一次仪器维护，观察仪器的进出板是否顺畅，比色是否正常。2次鉴定之间要作至少一次的期间核查，自行配制比色样品，进行重复检测，观察重复性。,ELISA检测需注意的问题：酶标仪的维护及核查,洗板机也是影响试验准确性的重要仪器。洗板机每天开/机关机必须进行冲洗1-3次。冬季洗板机要加强维护，每次开机前确保注液吸头和排液吸头是通畅的，没有被磷酸盐溶液堵塞。洗板完要进行拍板，注意观察残留量的多少。孵育时板孔上一定要贴膜,ELISA检测需注意的问题：洗板机的维护,在试验最后一步比色的时候，要设定基线值。一般设定1个空白孔，以空白孔的OD值为基线值，也就是常说的空白孔调零。 样品OD值=实测值-空白值另一种方法是设定双波长，一般是设定450nm和620nm波长。 样品OD值=450nm实测值-620nm实测值 双波长测定理论上能抵消干扰物质的OD值，优于单波长检测。 实际试验中，一般要求设空白孔，又建议双波长检测，如果同时使用会导致最终结果偏低。因此对于单次试验建议只使用一种方法。,ELISA检测需注意的问题：比色波长的设定,临界值（cutoff值）是界定样品阴阳性的标准 以珠海丽珠为例： cutoff值=NC+0.15。 （阴性对照0.08，按0.08计算） 注意说明书的小字部分 因此在NC0.08时，cutoff值=0.230.S/CO值的计算： S/CO值=样品OD值/cutoff值 S/CO值1为阳性，反之为阴性。 艾滋病的检测没有灰区,ELISA检测需注意的问题：Cutoff值计算,外部质控目的： 为了监控检测的重复性和稳定性， 试剂盒批间或孔间差异。 质量控制是实验室的“灵魂”包括强阳性、弱阳性和阴性对照血清。也可以只设置一个弱阳性对照，以该试剂盒临界值（cutoff值）的23倍为宜。,ELISA检测需注意的问题：外部质控的设定,ELISA检测需注意的问题：其他注意事项,按说明书设置阴、阳性的对照孔数量，不可随意减少 观察样本的形状，有无溶血和富脂质血 观察水浴箱内的温度计指示，和水箱水位高度 观察残留量，吸、排液孔是否堵塞（特别是冬季） 及时校准酶标仪，注意空白孔的数值 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检验合格、在有效期内的试剂。推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。,检测试剂的选择,按照中国疾控中心性病艾滋病预防控制中心网站上公布的质量评估报告选择前几位的试剂公司,常用的实验方法-胶体金/硒法,样本量要加足，对于粘稠的血清，也要适量加入稀释液 观测时间要严格控制，15-30分钟。过长过短都容易造成失误，建议配计时器。快速实验也必须填写原始记录，有条件的单位，使用拍照/摄像仪器进行实验结果记录。,常用的实验方法-化学发光法,敏感度较高假阳性的产生增多注意复测，对样本质量要求较高，尽量使用血清进行检测工作人员操作时，注意自身安全防护仪器的鉴定，每年厂家都要出具检测证书质量控制要求与酶联免疫法相同,实验时需要注意的事情,实验前： 调整室温至18-25（开空调） 平衡试剂30分钟，确认有效期（提前从冰箱取出试剂盒） 清点样本数量，进行“唯一性”编码（不可每日从1号开始） 预热仪器，检查仪器状态（莫到要用了，才发现坏了）,实验中： 严格按照说明书进行检测，随时阅读 准备“实验记录本”，边做边记录时间、实验结果及特殊状况等 将血清编号，完善储存，及时清理消毒生物安全柜及周边环境实验后： 进行原始记录的书写，完成仪器使用登记 发出检测报告,原则：“只要做实验就要写记录” 内容包括：96孔定位表:样本的位置要与OD结果相对应 试剂类型、厂家、批号及有效期 环境温/湿度 简要的操作步骤，Cutoff值的计算公式 实验小结：主要描述样本结果的阴阳性， 阳性反应结果必须标清样本的唯一性编号 最重要的2人手写签名此处看图片,酶标法检测原始记录的书写,原始检验记录不得携出所外，不得私自泄露有关内容。实验记录应按规定定期装订归档保存（线状或胶装），此项为现场督导必查内容。检验或试验结果无论成败，均应详细记录，失败的应及时总结分析，并在原始记录上注明。检验记录如发现有误，可在原处加一斜线划去，并签名或盖章，必要时注明情况，但不得涂改，原处字迹必须清晰可辨。,报告格式： 阴性报告“HIV抗体阴性（-）”阳性反应样本填写“HIV复检检测单”和“阳性样本转运登记表”；并同时填写电子版发往。需及时发送，以免耽误报告的发放样本装入2ml的螺帽口冻存管，用油性记号笔标注姓名；三层包装，使用生物转运箱专人专车；在冻存状态下及时送往济南市疾控中心艾滋病确证实验室（13楼）,WHO提出的三级包装系统：,第一层容器：冻存管 直接装样品，应防渗漏 标明样品的唯一性编码和受检者姓名 在试管的周围应有缓冲吸水材料，以免碰碎,第二层容器： 容纳并保护冻存管，可以装若干个冻存管。要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。,WHO提出的三级包装系统：,第三层容器:生物安全转运箱 贴有醒目的标签 便于携带，坚固并易于消毒,WHO提出的三级包装系统：,样本的包装,送检单应与样品分开放置,填写仪器使用登记： 必须填写的是：生物安全柜、酶标仪、洗板机、水浴箱填写其他相关记录： 环境检测记录、消毒记录、废弃物处理记录、冰箱监测记录等 注：有冷链监控系统的，也应每月打印一张监控图备案查询数据库的录入，及时标注质控点、绘制质控图 检测数据结果要求纸质及电子双记录，以便查询 质控图需及时绘制，以观察实验稳定性 每月5日之前，上报双系统的月报,仪器使用及相关记录的填写,艾滋病筛查实验室还应做的工作,承担部分艾滋病咨询工作 对于“HIV抗体不确定（）”患者，及时通知本人，四周后再次复检。 对患者提出的艾滋病相关问题，耐心细致回答的义务 妥善保存血清样本，长时间保持血清样本，应-20/-70 冻存。 对于血清检测量较大的医院，应将阴性血清保存2周-1个月。 按年度装订各项检测资料，并编写目录，方便查阅。每年接收艾滋病筛查中心实验室的盲样考核和现场督导每年派工作人员参加艾滋病相关培训,实验室质量控制,什么是质控品，有什么用？,质控品是强阳性、弱阳性和阴性的质控血清。目的：监控试验检测的重复性而设置的。 可以只设置一个弱阳性质控 标准是：以该试剂盒临界值（Cut-off）的23倍为宜。,购买商品化的质控品（推荐） 向生物制品公司或试剂生产厂家购买自行配制 使用HIV阳性血清+阴性血清，稀释而成（不建议）,怎么获得质控品？,60/110l阳性血清,60/110l阴性血清,60/110l阴性血清,60/110l阴性血清,60/110l阴性血清,60/110l阴性血清,60/110l阴性血清,如果购买了高浓度的质控品，请稀释,将梯度稀释后的样品同普通样品一样进行OD值测定,每一次实验必须使用室内质控品，以便监控实验的重复性室内质控品的管间或瓶间变异系数（cv20%）质控品应稳定、无菌，且不含有影响试剂反应的防腐剂。,分装冻存 多分装，每管留够用1个月的量就可以 注意有效期。购买的按照说明书； 自行配制的多为半年或1年。 保留好购买、配制及稀释分装等文字资料。 盲样考核时需提供,怎么保存质控品？,每次做实验时，将质控品作为普通样本进行检测在上批次的质控品快要用完时，提前购买新一批的质控品将新质控品当普通样本检测20次，获得新质控品的基础数据值，并妥善记录存档,怎样使用质控品？,错误的理解1：酶联免疫法是质控方法吗？ ELISA是检测方法，非质控方法错误的理解2：所有的实验室都是用即刻法+ L-J法吗？ 一年检测量少于20次的使用即刻法 一年检测量大于20次的使用（即刻法）+ L-J法,什么是质控方法，怎么用？,第一次使用质控品时，可一次做3个孔，第3个数值就可以进行质控了之后每次试验，做1个孔，记录数值。直至满20次。然后排序、计算均值、标准差、变异系数计算SI上限值和SI下限值比对SI值表，判断是否受控,即刻法怎么做？,将质控血清的测定值从小到大 排列： x1，x2，x3xn (x1为最小值，xn为最大值)。计算平均值和标准差。计算SI上限值 和SI下限值。将SI上限、SI下限与“SI值表”中的数字比较。每增加一个测定值都要重新计算平均值和标准差，重复以上各项计算,即刻法的计算方法,全国艾滋病检测技术规范2009版中有原图,以上数据均使用电脑计算,在“即刻法”的基础上做即刻法产生的20个数据转为基础数据根据基础数据计算“L-J”中的均值、标准差从第21个数据开始L-J法的质控,L-J法怎么做？,质控原则及标准,在控：质控数值的大小在的范围内告警：当质控数值超出的范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察失控：当质控数值超出的范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受,位移：连续几次（35次）质控值落在均值的一侧则称为位移，提示实验条件发生了较大的变化。 更换了新的试剂盒孵育时间和温度不准确更换新的检验人员、更换了新的仪器设备（加样器、洗板机、酶标仪等）趋势：连续几次（57次）外部对照S/CO值几乎按一个方向分布时称为趋势，通常由参数的缓慢改变引起。,质控原则及标准,必须停止检测查找原因的情况如下 出现一次3s范围的变化 连续两次出现同一方向2s范围的变化 连续四次出现同一方向的1s范围的变化 连续10次结果都在1s范围内，但落在均值线的同一侧。口诀：一三二二四十一,质控原则及标准,质控方法：“即刻法”或“L-J法”。实验方法如：“ELISA法”或“化学发光法”。实验用试剂厂家、批号及有效期质控点的检测时间及测量值或S/CO值。质控图需划线标注：均值（1-3）倍标准差。要有质控人员及复核者的双人手写签名。,完整质控图需要,52,当质控值超出允许范围,停止检测查出并纠正问题重复检测患者样本和质控物 问题解决和质控结果正确后再报告患者结果,SOP文件,SOP目录要体现： 单位名称、实验室编号等信息 SOP文件编写形成和修改日期 分类标题和页码编号 格式不限，内容全面即可 见模板,艾滋病筛查实验室SOP应有以下内容 按照省疾控下发的实验室考核标准，重新进行编订 此次现场督导，SOP不合格现象非常普遍，这将是明年的督导和考核重点,SOP文件,SOP文件,SOP是标准操作规程，是实验操作中的“法律、法规”，由它来指导我们该如何进行工作，需要注意的事项，是试验中的理论指导，也是实验室的“精神支柱”。现在存在SOP更新缓慢甚至从未更新过的现象。,艾滋病职业暴露的处理,一、 HIV职业暴露的概念 定义: HIV感染者及病人的血液或体液，（阴道分泌物、羊水）及含有HIV的实验室样本，污染了医务人员破损的皮肤、黏膜或被针刺伤或利器割伤。二、感染的条件 足量的病毒 病毒能够存活有病毒排出 有侵入的伤口,三、暴露的途径： 1. 皮肤损伤：针刺损伤、皮肤的切割伤。2.粘膜暴露： 粘膜部位如眼、鼻、口腔等接触HIV或含有HIV的血液、羊水等。四、职业暴露的传染源 HIV感染者或艾滋病人的血液、羊水、含血体液、阴道分泌物。含HIV的实验室样本、生物制品、器官等。,五、职业暴露常见人群 一类危险人群：护理人员、医生（妇产科）、助产士。 二类危险人群：血库或化验室的工作人员、尸检人员。 其余危险人群：清洁被血液和污染的环境者 对被血液和污染的器具祛污、消毒、维护者 处理污染的被服和废弃物者 处理盛有污染利器的容器者 处理和运输生物学标本时 对有潜在污染可能的水管进行维护者 即：凡提供医疗服务的大多部门均有可能发生职业暴露,六、造成职业暴露可能因素1.没有安全防护的规章制度 2.没有按照常规进行操作3.对职业暴露缺乏自我保健的意识4.缺乏职业暴露的专业知识5.不可避免地处于高度暴露的环境,七、不会发生职业暴露的情况1.在不直接接触血液和感染性体液的情况下给HIV感染者或艾滋病人做常规体检；2.接触到HIV感染者或艾滋病人的尿液或汗液；3.与HIV感染者或艾滋病人谈话、握手。,八、HIV职业暴露的处理原则 1.现场处理 2.报告及保密 3.风险评估 4.监测及随访 5.预防用药,1.现场处理：急救（1）如有伤口，应轻轻挤压，使其尽量挤出血液，用肥皂水或清水冲洗。（2）受伤部位的消毒：伤口应用消毒液（如75%酒精，0.2%次氯酸钠，0.2-0.5%过氧乙酸，0.5%碘伏等）浸泡或涂抹消毒，并包扎伤口。（3）暴露的粘膜，应用清水或生理盐水冲洗干净。,紧急处理可以减少80%的感染,2.报告与保密,（1）为获得正确的处理，需及时通知其上级领导，（需经本人同意）（2）每一个得到信息的机构或个人应严守秘密（3）主管机构应详细记录所发生的情况（4）包括受污染者个人资料、时间、地点、污染部位、伤口类型（深浅、大小、有无出血）、污染物的情况（如HIV的血液、HIV培养液等）（5）如可能，获悉病人的血浆病毒载量、是否接受过治疗及所用药物的种类。,3. 风险评估,暴露源的情况,4.监测及随访,（1）HIV职业暴露发生后，应立即抽取被暴露者的血样作HIV抗体本底检测，以排除是否有既往HIV感染。 （2）如检测结果阴性，不论经过危险性评估后是否选择暴露后预防用药，均应在事故发生后第4周、8周、12周、6个月、12个月时分别抽取血样检测HIV抗体，以明确是否发生HIV感染。 （3）有条件情况下，可以采用核酸分析和病毒培养等进行早期诊断。,（4）对暴露者的身体情况进行观察和记录观察暴露者是否有HIV感染的急性期临床症状，可以更正确地估计感染的可能性，及时调整处理措施或用药方案。了解暴露后是否存在除HIV感染外的其他危险，如外伤、感染引起的败血症、HBV、HCV感染等，给予相应的治疗。对于预防用药者可了解药物的副作用及对药物的耐受情况，给予及时处理。,（5）从暴露发生1年内，应将被暴露者视为可能的HIV传染源加以预防。具体措施主要包括：性交时使用安全套育龄妇女暂缓怀孕孕妇要根据危险性评估的结果权衡利弊，决定是否终止妊娠哺乳期女性应中断母乳喂养改用人工喂养在生活中避免与他人有血液或感染性体液的接触或交换等,5.暴露后的预防用药,（1）HIV从局部到全身的感染需要一段时间，在此期内使用抗逆转录病毒药物可阻止病毒的复制。 （2）HIV暴露后应尽早使用抗逆转录病毒的治疗，通过限制靶细胞或淋巴结中病毒的复制而阻止HIV全身的感染。,（3）药物预防的时间,专家推荐最好在暴露后12小时，最长不超过24小时内用药；动物实验研究显示在暴露后2436小时开始服药将无预防作用。美国CDC仍推荐对情况严重的职业性暴露，即使暴露后12周仍应该预防用药。职业暴露后预防用药的疗程一般为28天。,九、怎样避免发生职业暴露 1.严格落实制度 2.严格执行个人健康监护 3.安全使用仪器设备 4.废弃物消毒和处理,暴露发生后的处理程序,HIV职业暴露发生,局部紧急处理,危险性估计,报告,不选用药,选择用药,用药监测,HIV监测及随访、健康咨询、心理咨询,暴露了怎么办？,记住4原则：急救 报告 保密 知情及时处理原则：局部急救处理报告原则：按规定程序上报，与急救同时进行。 目的：尽早评估，尽早用药。保密原则：对职业暴露涉及的人员，应做好保密工作。 不向无关人员泄露相关信息。知情同意原则：是否吃药，需要您自己决定。,暴露了怎么办？,暴露后怎么办？,记住4步曲：挤压 清洗 消毒 包扎 刺激出血：如皮肤有伤口，应当在伤口旁端轻轻挤压，尽可能挤出损伤处的血液。用洗手液和流水清洗伤口或污染的皮肤。如果是粘膜，用大量生理盐水冲洗。受伤部位的伤口冲洗后，用0.5%碘伏进行消毒，并包扎伤口。到艾滋病专业防治机构进行进一步咨询和处理。,采集样品注意事项,离心机要使用密闭的罐和密封头，以防液体溢出或形成气溶胶。四个不要：不要把用过的锐利器具（针头）传递给别人；对用过的针头不要用手去重新盖上针套；不要用手从一次性注射器上移去针头不要用手弯曲、折断或处置用过的针头；,艾滋病实验室生物安全,HIV的稳定性和敏感性,对消毒剂敏感对臭氧敏感对紫外线不敏感56,30min灭活干燥环境：数分钟内死亡,HIV在外界环境中的生存能力弱,生物安全,表面消毒：75%乙醇 喷洒或擦拭（喷壶）浸泡消毒：0.5%次氯酸 30min高压蒸汽灭菌条件：121 30min（高压锅）空气消毒：30mg/m3臭氧 30min 24%甲醛 熏蒸12h（不常用）,79,实验室采用的消毒灭菌条件,生物安全,HIV传播途径,不经空气传播血、性、母婴垂直传播,经破损皮肤感染是HIV职业暴露的主要途径,穿个人防护装备，戴双层乳胶手套， “检漏”,禁入：免疫力低下、感冒发烧者皮肤破损者,禁用：锐器：剪刀、针头、刀片玻璃器材,生物安全,实验室内不要饮食、抽烟、处理隐形眼镜、使用化妆品、存放食品等。建议工作人员进行工作时不要佩戴隐形眼镜。必要时可带护目镜。不能穿短袖工作服。,81,生物安全,严禁用口吸移液管, 严禁将实验材料置于口内。严禁舔标签。污染的液体在排放到生活污水管道以前必须清除污染（采用化学或物理学方法）。根据所处理的微生物因子的危险度评估结果准备专门的污水处理系统。只有保证在实验室内没有受到污染的文件纸张才能带出实验室,生物安全,83,实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的物品。每天工作结束后应清除工作台面的污染。若发生具有潜在危害性的材料溢出应立即清除污染。如果窗户可以打开，则应安装防止节肢动物进入的纱窗。,生物安全,84,生物安全,常用防护用品,办公室,采集样品注意事项,用过的注射器及针头直接放到利器桶中，统一进行高温消毒，121，30分钟；其它实验室废弃物统一放入黄色垃圾袋中，交给医疗垃圾处理单位，禁止自行随生活垃圾一起处理。吸取血清等操作时必须用一次性吸管或更换枪头，否则易发生交叉污染。,针头处理,针头收集器,正确的取针头方式,