凝集试验

布鲁氏菌病检测,一、概念： 布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌引起的人、畜共患的传染病。在家畜中，牛、羊、猪最常发生，且可由牛、羊、猪传染给人和其他家畜。其特征是生殖器官和胎膜发炎，引起流产、不育和各种组织的局部病灶。,二、检测技术血清学检测技术病原学检测技术,（一）血清学检测技术1、凝集反应 抗原与抗体之间具有特异性的化学亲和力，当它们比例合适时，则构成一个大复合物，在电解质(一般用生理盐水)的作用下,形成肉眼看可见凝集现象，因此称为凝集反应。,2、虎红平板凝集试验2.1 材料准备2.1.1 抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。2.1.2 受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和腐败气味。,2.1.3 洁净的玻璃板，其上划分成4cm的方格。2.1.4 吸管或分装器，适用于滴加0.03ml。2.1.5 牙签或火柴杆，供搅拌用。,2.2 操作方法2.2.1 将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清 0.03ml 。2.2.2 在受检血清旁滴加抗原 0.03ml 。2.2.3 用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。2.2.4 每次试验应设阴、阳性血清对照。,2.3 判定2.3.1 在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。2.3.2 受检血清在4min内出现肉眼可见的凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为（-）。,虎红平板凝集试验照片,虎红平板凝集试验照片,虎红平板凝集试验照片,虎红平板凝集试验照片,虎红平板凝集试验照片,3 布病试管凝集试验3.1 材料准备3.1.1 稀释液 0.5%石炭酸生理盐水，检验羊血清时用含有0.5% 石炭酸的10%盐溶液，如果稀释用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，抗原的稀释亦用含0.5%石炭酸的10%盐溶液。,3.1.3 凝集试验管（三分管）、试管架、吸管及温箱。3.1.2 抗原、阳性血清和阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。,3.2 操作方法3.2.1 按常规方法采血分离血清。3.2.2 运送和保存血清样品时防止冻结和受热，以免影响凝集价。若3d内不能送到实验室，按每9ml血清加1ml 0.5%石炭酸生理盐水（徐徐加入）防腐，也可用冷藏方法运送血清。,3.2.3 受检血清的稀释3.2.3.1 第1管标记检验编码后加1.15ml稀释液。3.2.3.2 第24管各加入0.5ml稀释液。,3.2.3.3 然后用1ml 吸管取被检血清0.1ml；加入第1管内，并混合均匀。混合方法是将该试管中的混合液吸入吸管内，再沿试管壁吹入试管中，如此吸入、吹出34，充分混合后以该吸管吸混合液0.25ml弃去。,3.2.3.4 取0.5ml混合液加入第2管，用该吸管如前述方法混合。3.2.3.5 再吸第2管混合液0.5ml至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去混匀液0.5ml。,3.2.3.6 稀释完毕，从第1至第4管的血清稀释度分别为1:12.5 ; 1:25 ; 1:50 和1:100。3.2.3.7 牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致，差异是第1管加1. 2ml稀释液和0.05ml被检血清。,3.2.3.8 将0.5ml 20倍稀释的抗原加入已稀释好的各血清管中，并振摇均匀，羊和猪的血清稀释则依次变为1:25 ; 1:50 ; 1:100和1:200，牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为1:50 ; 1:100；1:200和1:400。大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、骆驼用1:50 和1:100，猪、山羊、绵羊和狗用1:25 和1:50 。,布鲁氏菌病试管凝集反应试验（牛）,布鲁氏菌病试管凝集反应试验（羊）,3.2.3.10 每次检验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，即 a) 阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。 b) 阳性血清对照：阳性血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与受检血清同。 c) 抗原对照： 1:20稀释抗原液0.5ml ，再加0.5ml 稀释液，观察抗原是否有自凝现象。,注：试管凝集试验简便方法,试管凝集试验也可用较简便方式进行，即将血清以0.08毫升、0.04毫升、0.02毫升及0.01毫升分别加入四支小试管内，然后每管加入1：40稀释的抗原1毫升，充分摇匀，这样4管血清的最后稀释度分别为1：25、1：50、1：100和1：200,3.3 判定3.3.1 供判定参照比浊管制备方法,3.3.2 置37 40温箱24h，取出检查并记录结果。,3.3.3 结果判定3.3.3.1 凝集反应程度分为：参照比浊管，按各试管上层液清亮度判读 a) + 菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮； b) + 菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮； c) + 菌体凝集显著，液体50%清亮； d) + 凝集物有沉淀，液体25%清亮； e) 凝集物无沉淀，液体均匀浑浊。,3.3.3.2 牛、马、鹿和骆驼1:100血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗用1:50血清稀释，出现“+”以上凝集现象时，受检血清判定为阳性。,3.3.2.3 牛、马、鹿和骆驼1:50血清稀释，猪、山羊、绵羊和狗用1:25血清稀释，出现“+”以上凝集现象时，受检血清判定为可疑反应。,布病试管凝集试验照片,布病试管凝集试验照片,布病试管凝集试验照片,布病试管凝集试验照片,布病试管凝集试验照片,可疑反应家畜经3周4周后重检，如果仍为可疑，该牛、羊判为阳性。猪和马经重检仍保持可疑水平，而农场的牲畜没有临床症状和大批阳性患畜出现，该畜被判为阴性。,猪血清偶有非特异性反应，须结合流行病学调查判定，必须要时应配合补体结合试验和鉴别诊断，排除耶森氏菌交叉凝集反应。,布鲁氏菌病检测结果记录表 检品编号： *号 样品名称： 检测方法： 虎红平板凝集、试管凝集 检测时间： 备 注: GB/T 18646-2002 共 页第 页,检验人员： 复核人： 年 月 日,试管凝集反应试验原始结果记录表,检验人员： 复核人： 年 月 日,病原学技术,一、分离培养和培养基1 分离培养 凡从可疑病畜、野生动物或者可疑物中分离到布鲁氏菌，即可诊断为布鲁氏菌病或带菌。目前已清楚了解，除了外界环境中有布鲁氏菌存在外，还在60多种家畜和野生动物中分离到了布鲁氏菌。 分离到布鲁氏菌是了解疫情、分析疫情、判断疫情的最可靠资料。,1.1 牲畜材料中的布鲁氏菌分离培养方法1.1.1 流产胎儿培养方法: 流产胎儿取来后，先用清水把泥土等污物洗净，然后在3%的来苏儿中浸泡半小时以上，取出在无菌条件下进行解剖。分别取出淋巴结、肝、脾、胃内容物、肺和骨髓等接种在普通培养基或者选择性培养基上，置37 温箱培养。一般情况下35天即可获得阳性结果。2周内无阳性结果可停止培养。牲畜流产胎儿或者死羔犊是布鲁氏菌分离培养最可靠、最有价值的细菌学材料。在流产胎儿的细菌分离中各种器官均有较高的分离率，尤其肺、脾和胃内容物。,1.1.2 胎衣的检查：取流产和正产的胎衣用清水洗去粪便等污物，再剪下数个子叶，用灭菌生理盐水冲净，然后用灭菌研磨器研碎或剪碎，接种在选择培养基上或做生物学检查。,2 布鲁氏菌的培养基及其制备方法2.1 土豆琼脂培养基：蛋白胨 10克 琼脂 15克氯化钠 5克 牛肉浸膏 5克 葡萄糖 10克 甘油 812克 1:2土豆浸液500毫升 蒸馏水500毫升 除葡萄糖外，将上述各成分混合熔化，用多层纱布过滤，用20%的氢氧化钠调pH7.2,加入葡萄糖，分装，15磅高压20分钟备用。 1:2土豆浸液的制备：新鲜土豆去外皮，切成块，称取500克，放1000毫升蒸馏水中加热煮沸，熟了为止（约10分钟），用纱布过滤，其液体置15磅高压20分钟备用。,2.2 肝浸液琼培养基： 蛋白胨 10克 氯化钠 5克 琼脂 15克 1:4肝浸液 1000毫升 将上述各成分混合熔化，用多层纱布过滤，用20%的氢氧化钠调pH7.2,分装，15磅高压20分钟备用。 1:4肝浸液的制备：取新鲜牛肝（羊和猪肝也可以）去其脂肪和结缔组织后用清水轻轻洗，用绞肉机绞碎称取250克，加入蒸馏水1000毫升，在冰箱中浸泡24小时，取出加热煮沸到熟为止，用帆布或纱布脱脂棉过滤，15磅高压20分钟备用。,2.3 胰蛋白胨琼脂培养基：胰蛋白胨20克 葡萄糖 10克 氯化钠 5克 琼脂 20克 蒸馏水 1000毫升 先把琼脂放在蒸馏水中加热熔化，然后将上述其余各成分加入熔化，用纱布脱脂棉过滤，调pH6.8 7.0，分装，13磅高压30分钟备用。,二、防止与个人防护1 防止经皮肤感染、粘膜感染和呼吸道感染,1.1 防止家畜流产物引起感染：接羔助产人员，在接种羔助产和处理胎儿，死羔时，应做好个人防护，除备有工作服，橡皮围裙、帽子、口罩和胶鞋外，还应该戴乳胶手套和线手套，备有接羔袋和消毒液，严禁赤手抓拿流产物。家畜的流产胎儿、胎盘、胎衣或死胎等，不要随意丢弃，以防污染环境或被狗吃掉引起布病传播。,1.2 防止经粘膜感染:这里所指的粘膜感染主要是指性器官粘膜。实践证明，布氏菌很容易经性器官粘膜感染发病。,1.3 防止经呼吸道感染：布氏菌可悬浮在空气中，随空气尘埃经呼吸道进入体内。因此防止呼吸道感染对预防布病是非常重要的。,2 个人防护措施2.1 防护装备的作用在于保护人体，防止布鲁氏菌侵入人体。因此，