大肠菌群

GB 4789.32010食品微生物学检验大肠菌群计数,标准名称,食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数National food safety standardFood microbiological examination:Enumeration of coliforms,大肠菌群定义,在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。,大肠菌群的定义,大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是一组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括：大肠埃希氏菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌。生化特征及血清学反应并非完全一致。,大肠菌群的定义,分布： 广泛分布于自然环境。 来源于人和温血动物的粪便。 卫生学意义 大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。 大肠菌群计数的高低，直接反映了样品受粪便污染的程度。 表示对人体健康是否具有潜在的危险性。,GB 4789.32010大肠菌群计数,第一法MPN法第二法平板计数法,大肠菌群计数：第一法,美国食品药品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Chapter 4： Enumeration of Escherichia coli and the Coliform BacteriaISO 4831:2006 Microbiology General guidance for the enumeration of coliforms Most probable number technique,大肠菌群检验流程图(MPN法),检样(25g/ml样品+225稀释液）稀释（10倍稀释）月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）36， 24482h不产气 产气 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 36， 24482h不产气 产气大肠菌群阴性 大肠菌群阳性报告,大肠菌群检验(MPN法),6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品，放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000r/min均质1 min2 min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min，制成1:10的样品匀液。,大肠菌群检验(MPN法),6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3 样品匀液的pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl调节。,大肠菌群检验(MPN法),6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。,大肠菌群检验(MPN法),6.2 初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），361 培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。,月桂基磺酸盐胰蛋白胨（LST）,月桂基磺酸钠（十二烷基硫酸钠）能抑制革兰氏阳性菌的生长，同时比胆盐的选择性和稳定性好。LST更容易观察。由于胆盐与酸产生沉淀，沉淀有时候会使对产气情况的观察变得有些困难； 乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌；胰蛋白胨提供基本的营养成分；LST肉汤是国际上通用的培养基，与乳糖胆盐肉汤的作用和意义相同，但具有更多的优越性。,LST初发酵,大肠菌群检验(MPN法),6.3 复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1培养48h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。,大肠菌群检验(MPN法),煌绿乳糖胆盐肉汤BGLB胆盐可抑制革兰氏阳性菌。煌绿是抑菌抗腐剂，可增强对革兰氏阳性菌的抑制作用。乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌。复发酵试验判定原则：产气为阳性。由于配方里有胆盐，胆盐遇到大肠菌群分解乳糖所产生的酸形成胆酸沉淀，培养基可由原来的绿色变为黄色，同时可看到管底通常有沉淀。,BGLB复发酵,大肠菌群检验(MPN法),注意事项发酵试验判定原则：产气为阳性。检测步骤减少（不必分离培养），检测时间缩短24 h。如接种量超过1 mL，则应用双料LST肉汤。,大肠菌群检验(MPN法),6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。,MPN表,MPN表注意事项,当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值时，如：阳性管数为122，123，232，233等时，建议增加稀释度(可做45个稀释度)，使样品的最高稀释度能达到获得阴性终点，然后再遵循相关的规则进行查找，最终确定MPN值。,检样量的选择注意事项,注1：本表采用3个稀释度0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和0.001 g(mL)，每个稀释度接种3 管。注2：表内所列检样量如改用1 g（mL）、0.1 g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01 g(mL)、0.001g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。,第二法平板计数法,大肠菌群计数：第二法,美国食品药品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Chapter 4：Enumeration of Escherichia coli and the ColiformBacteriaISO 4832:2006（E） Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the enumeration of coliforms Colony-count technique,大肠菌群计数：第二法,适用范围与培养基平板计数法相对于MPN法来说，检验结果 更精确。适合用于污染比较严重的样品，但对于污染菌量太少的样品，还是MPN法更有优势。所用培养基：VRBA琼脂、BGLB培养基。,大肠菌群 第二法的检验程序,检样25g(mL)+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择23个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板361 1824h计数典型和可疑菌落BGLB肉汤证实试验361 1824h报告结果注：VRBA(结晶紫中性红胆盐琼脂)又称为：VRB或VRBL,大肠菌群 第二法的检验程序,操作要点8.1 样品的稀释按6.1进行（第一法）。8.2 平板计数8.2.1 选取2个3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。8.2.2 及时将15 mL20 mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 1 培养18 h24 h。,大肠菌群在VRBA上的菌落特征,大肠菌群 第二法的检验程序,8.3 平板菌落数的选择选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。,大肠菌群 第二法的检验程序,8.4 证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，361 培养24 h48 h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。,大肠菌群 第二法的检验程序,8.5 大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/1010-4/g(mL)6.0105 CFU/g(mL),大肠菌群 第二法的检验程序,结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA） VRBA的主要成分：乳糖、胆盐、结晶紫、中性红及细菌生长所必需的营养成分如：蛋白胨、酵母膏等。结晶紫和中性红为VRBA的指示剂系统，在酸性条件下为紫红色。 大肠菌群分解乳糖所产生的酸与胆盐结合，可形成沉淀。,大