生物固氮及其发展前景

生物固氮及其发展前景 摘要 本论文主要介绍生物固氮概念 固氮微生物及其种类和生物 固氮发展前景 关键词 生物固氮 固氮微生物 固氮生化机制 生物固氮展望 引言 生物固氮是一个具有重大理论意义和实用价值的生化过程 生物固氮反应是一种及其温和及零污染排放的生化反应 它比人类 发明的化学固氮有这无比的优越性 因后者需要消耗大量的石油原 料和特殊的催化剂 并须要在高温 300 高压 300 个大气 压 下进行 此外 若不合理地使用氮肥 还会降低农产品的质量 破坏土壤结构和降低肥力 以及造成坏境污染 如湖泊的水华和海 洋的赤潮 等恶果 我国在近半个世纪当中 化肥产量猛增近 6000 倍 其有害影响已不断出现 因此 我们应深刻认识到 只有深入 研究 开发和利用固氮微生物 才能更好的发展生态农业和达到土 地可持续利用的战略目标 如果把光合作用旱作是地球上最重要的 生化反应 则生物固氮作用便是地球上仅次于光合作用的生物化学 反应 因为它为整个生物圈中一切生物的生存和繁荣发展提供了不 可或缺和可持续供应的还原态氮化物的源泉 内容 生物固氮定义 指大气中的分子氮通过微生物固氮酶的催 化而还原成氨的过程 生物界中只有原核生物才具有固氮能力 固氮微生物的种类 1 自生固氮菌 1 好氧 化能异养 化能自养 光能自养 2 兼性厌氧 化能异养 光能异样 3 厌氧 化能异养 光能自养 2 共生固氮菌 1 根瘤 豆科植物 非豆科被子植物 2 植物 地衣 满江红 3 联合固氮菌 1 根际 热带 温带 2 叶面 3 动物肠道 固氮的生化机制 1 生物固氮反应的 6 要素 1ATP 的供应 由于 N N 分子中存在 3 个共价键 故要 把这种极端的分子打开就得花费巨大能量 固氮过程中把 N2 还原 成 2NH3 时消耗的大量 ATP N2 ATP 1 18 24 是由呼吸 厌氧呼吸 发酵或光合磷酸化作用提供的 2 还原力 H 及其传递载体 固氮反应中所需大量的还原 力 N2 H 1 8 必须以 NAD 的形成提供 由 低电势的电子载体铁氧还蛋白 一种硫铁蛋 白 或黄素氧还蛋白 一种黄素蛋白 传递至固氮酶上 固氮酶 固氮酶是一种复合蛋白 由固二氮酶还原酶 两种相互分离的蛋白构成 它们对氧都高度敏感 固二氮酶是一种 含铁和钼的蛋白 铁和钼组成一个称为 的辅助因 子 它是还原 的活性中心 而固二氮酶还原酶则是只含铁的蛋 白 某些固氮菌处于不同生长条件下时 还可合成其他不含钼的固 氮酶 称为 替补固氮酶 具有适应极度缺钼环境下还能正常进行 生物固氮的功能 4 还原底物 N2 5 镁离子 6 严格的厌氧微环境 2 测定固氮酶活力的乙炔还原法 测定固氮酶活力的经典方法曾有过粗放的微量氏定氮法和烦琐 的同位素法等 1996 年 M J Dilworth 和 R Scholhorn 等人分别发表 了既灵敏又简单的利用气相色谱仪测定固氮酶活性的乙炔还原法 大大推动了固氮生化的研究 已知固氮生化除了能催化 N2 NH3 的反应 还可能催化许多 反应 包括 2H 2e H2 和 C2H2 C2H4 等反应 在后一反应 中 这两种气体量的微小变化也能用气相色谱仪检测出来 测定时 只要把带测测细菌制成悬浮液 放在含有 10 C2H2 空气 对好氧 菌 或 C2H2 的氮气 对厌氧菌 的密闭容器中 经适当培养后 按不同时间用针筒抽取少量的气体至气相色谱仪测定 即可获得是 否固氮及固氮强度等准确数据 由于乙炔还原法的灵敏高度 设备 较简单 成本低廉和操作方便 故很快成为任何研究固氮实验室中 的常规方法 3 固氮的生化途径 目前所知道的生物固氮的总反应是 N2 8 H 16 24ATP 2NH3 H2 16 24ADP 16 24Pi 整个固氮过程主要经历以下几个环节 由 Fd 或 Fld 向氧化型 固二氮酶还原酶的铁原子提供一个电子 使其还原 还原型的固 二氮酶还原酶与 ATP Mg 结合 改变了构象 固二氮酶在 FeMoCo 的 Mo 位点上与分子氮结合 并与固二氮酶还原酶 Mg ATP 复合物反应 形成了一个 1 1 复合物 即完整的固氮酶 在固氮酶分子上 有一个电子从固氮酶还原酶 Mg ATP 复合物 转移到固氮酶的铁原子上 这时固氮酶还原酶重新转变为氧化态 同时 ATP 也就水解成 ADP Pi 通过上述过程连续 6 次 用打点 子的箭头表示 的运转 才可使固二氮酶释放 2 个 NH3 分子 还 原一个 N2 分子 理论上仅需 6 个电子 而实际测定却需 8 个电子 其中 2 个消耗在产 H2 必须强调指出的是 上述一切生化反应都必须受活细胞中各种 氧障 的严密保护 以保证固氮酶免受失活 4 固氮酶的产氢反应 固氮酶除能催化 N2 NH3 外 还具有催化 2H 2e H2 反应的氢化酶的活性 当固氮菌在缺 N2 环境下 也只是把 75 的 还原力 H 去还原 N2 而把另外 25 的 H 以产 H2 的方式浪费掉了 然而 在大多数固氮菌中 还存在另一种经典的氧化酶 它能将被 固氮菌浪费了的分子氢重新激活 以回收一部分还原力 H 和 ATP 生物固氮的应用及其前景 大气中的氮 必须通过以生物固氮为主的固氮作用 才能被植 物吸收利用 动物直接或间接地以植物为食物 动物体内的一部分 蛋白质在分解过程中产生的尿素等含氮废物 以及动植物遗体中的 含氮物质 被土壤中的微生物分解后形成氨 氨经过土壤中的硝化 细菌的作用 最终转化成硝酸盐 硝酸盐可以被植物吸收利用 在 氧气不足的情况下 土壤中的另一些细菌可以将硝酸盐转化成亚硝 酸盐并最终转化成氮气 氮气则返回到大气中 除了生物固氮以外 生产氮素化肥的工厂以及闪电等也可以固氮 但是 同生物固氮相 比 它们所固定的氮素数量很少 可见 生物固氮在自然界氮循环 中具有十分重要的作用 1 农业应用 生物固氮在农业生产中具有十分重要的作用 氮素是农作物从 土壤中吸收的一种大量元素 土壤每年因此要失去大量的氮素 如 果土壤每年得不到足够的氮素以弥补损失 土壤的含氮量就会下降 土壤可以通过两条途径获得氮素 一条是含氮肥料 包括氮素化肥 和各种农家肥料 的施用 另一条是生物固氮 科学家在 20 世纪 80 年代推算过 全世界每年施用的氮素化肥中的氮素大约有 8 10 7t 而自然界每年通过生物固氮所提供的氮素 则高达 4 10 8t 对豆科作物进行根瘤菌拌种 是提高豆科作物产量的一项 有效措施 播种前 将豆科作物的种子沾上与该种豆科作物相适应 的根瘤菌 这显然有利于该种豆科作物结瘤固氮 特别是新开垦的 农田和未种植过豆科作物的土壤中 根瘤菌很少 并且常常不能使 豆科作物结瘤固氮 更需要进行根瘤菌拌种 对比实验表明 在其 他条件相同的情况下 经过根瘤菌拌种的豆科作物 可以增产 10 20 2 研究简况 1886 年在第 59 届德国科学家和医生学术讨论会上 德国学者赫 尔利格尔 Hermann Hellriegel 首次提出令人惊奇的试验结果 即当 大豆生长在缺氮的土壤中时 大豆的根瘤也能使其良好生长 其机 理在于其根瘤具有固氮功能 在当时称之为根生杆菌 现在称之为 大豆根瘤菌的细菌对豆科植物根部的根瘤形成具有特殊的刺激作用 在根瘤菌内 根瘤菌将大气中的氮还原为能被植物吸收利用的氨 豆科宿主在吸收了这些氨之后又能将其转变为含氮有机化合物 以 供其生长发育之需 通过对根瘤菌进行接种培养后于 1895 年就获得 了具有很强固氮能力的根瘤菌菌种 通过添加灭菌草木灰等吸附剂 之后 大批根瘤菌被施用到三叶草 豌豆和小扁豆等豆科作物的种 植地中以提高其产量 现在已经知道 在自然界具有固氮功能的生物种类很多 其中有 自养固氮生物和异养固氮生物这两大类型 在异养固氮生物中因宿 主植物的差异而被划分为豆科植物共生固氮菌和非豆科植物共生固 氮菌 尽管固氮生物多种多样 但在其固氮过程中都需要共同的固 氮基因 nif 的参与 在共生固氮生物中固氮体系非常复杂 除了 nif 基因在固氮过程中起关键性作用之外 其它基因的协同作用也非 常重要 由于根瘤菌具有的特殊功能 大批热心的研究者对其特征特性 对寄主的侵染方式 固氮机制和商业价值等进行了系统的研究 本 世纪 80 年代以来 学者们一方面从分子水平进一步研究根瘤菌在豆 科植物上的固氮机理和改造根瘤菌 试图培育出活性更强的根瘤菌 另一方面利用人工诱导方式诱发非豆科作物根部结瘤 试图利用根 瘤菌的特殊功能使非豆科作物也能共生固氮 以便减少农田中氮肥 的施用量 降低农作物的生产成本 除此之外 在 70 年代末 由于 在放线菌中发现了弗兰克氏菌 Frankia 与多种非豆科树木能共生 结瘤并具有固氮效应 因而在生物固氮研究中又产生了一个新的分 支 即以研究弗兰克氏菌的分类 功能 分布和应用前景为主要内 容的新领域 从现有的研究结果来看 与豆科植物的根瘤菌的固氮 体系相比 利用弗兰克氏菌具有广谱侵染的特性 对建立新的固氮 技术体系可能具有更大的意义 应用前景更广阔 3 展望 据测算 在大气中氮素含量为 3 9 1015 吨 在全球耕地内生物 固氮量理论上可达到 4400 万吨 约相当于全世界每年生产的化肥总 量 全球林地面积约为 4 1 亿公顷 其固氮总量可达到 4000 万吨 由于在氮素化肥生产中伴随着能源耗费和日趋严重的环境污染问题 人们逐渐认识到农林业生产完全依赖化肥终非良策 于是 生物固 氮研究日益受到各国政府的重视 通过适当方式固定大气中的游离氮素 将其转变为能参与生物体 新陈代谢的氨态氮是地球上维持生产力的一个重要的生态反应 从 战略上来考虑 正确的农业生产政策应该是既要增加粮食生产 又 不要损害土地的持久生产力 而生物固氮正好能同时满足这两个目 的 应用现代科学技术建立和完善生物固氮体系已经成为解决人类 目前所面临的人口 粮食 能源和环境等问题的重要技术措施 近 20 年来生物固氮已经成为一个多学科的综合性研究项目 分 别在分子 细胞 个体和生态等多层次水平上 从微观到宏观不断 地展开着探索性研究 从目前的研究现状来看 试图通过基因工程 将 nif 基因从豆科植物转移到非豆科农作物中难度比较大 在短期内 很难实现 而采用细胞工程方法将根瘤菌导入非宿主农作物细胞内 则切实可行 除此之外 由于 Frankia 菌具有对宿主的侵染范围宽 固氮活性比较强和对氧气不敏感等特性 在生物固氮研究中对 Frankia 菌的研究将更为重要 有可能由此会找到新的突破口 在 Frankia 菌与农作物之间建立起新的共生固氮体系将具有更大的可能 性 这项研究已呈现出新的苗头 值得进一步探索 生物固氮研究已经引起越来越多的人的关注 在这方面的研究今 后主要包括基础理论和应用基础这两个方面 在基础理论研究中主 要围绕着诱发非豆科作物结瘤的最佳条件和提高共生固氮效能 其 中包括诱导根瘤菌侵入主要农作物共生结瘤的有效方法 提高非豆 科农作物共生结瘤固氮的效能 根瘤菌导入非豆科宿主细胞的途径 共生部位和共生机理 采用适当的技术措施诱导 Frankia 菌与主要农 作物结瘤固氮 Frankia 菌共生结瘤固氮的机理等等 在应用基础研 究中主要围绕着培育新的固氮植物 其中包括通过生物技术改造固 氮微生物和现有的农作物 使新的固氮菌与新的农作物更容易形成 共生固氮关系 可