几种基因操作的工具酶

一 限制性核酸内切酶及其应用 一 限制性核酸内切酶的发现 当 k 噬菌体侵染 E coliB 时 由于其 DNA 中有 EcoB 核酸酶特异识别的碱基序列 被降解掉 而 E coliB 的 DNA 中虽然也存在这种特异序列 但可在 EcoB 甲基化酶的作用 下 催化 S 腺苷甲硫氨酸 SAM 将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基 使之甲基化 Eco 核酸酶不能识别已甲基化的序列 最早分离出的限制内切酶是在 1968 年 Meselson 和 Yuan 大肠杆菌 B 和 K 菌株 EcoB 和 EcoK 是 I 型的 没有实用价值 首个 II 型限制内切酶是在 1970 年 由 H O Smith 等从 Heamophilus influenzae 的 Rd 菌株中 Hind II 使得 DNA 分子的体外精确切割成为可能 从此 相关研究展开 如 NEB 公司的提取和克隆 目前已纯化出 3000 种限制性内 切酶中 其中有 30 是在 NEB 发现的 限制性核酸内切酶 restriction endonuclease 是一类能够识别双链 DNA 分子中的 某种特定核苷酸序列 并由此切割 DNA 双链结构的核酸内切酶 切开的是 3 5 磷酸二酯 键 二 限制性核酸内切酶的分类 分为 I 型 II 型和 III 型 三 限制性核酸内切酶的命名 1 寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 3 个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称 如大肠杆菌 Escherichia coli 表示为 Eco 流感 嗜血菌 Haemophilus influenzae 表示为 Hin 2 用一个正体字母表示菌株的类型 比如 EcoR Hind 3 如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系 则用罗马数字标出 比 如 Eco R I Hin d III 四 II 型限制性核酸内切酶的基本特性 1 识别位点的特异性 每种酶都有其特定的 DNA 识别位点 通常是由 4 8 个核苷酸组成的特定序列 靶序 列 2 识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称的结构 即双链的核苷酸顺序呈回文结构 3 切割位点的规范性 交错切或对称切 可形成粘性末端或平末端的 DNA 分子 与 II 型核酸内切酶有关的几个概念 粘性末端 cohesive ends 是指 DNA 分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的 单链延伸末端结构 它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来 平 末 端 Blunt end 在识别序列对称处同时切开 DNA 分子两条链 产生的平齐末端 结构 则不易于重新环化 同裂酶 isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶 不 同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别 同尾酶 isocaudamers 识别的靶序列不同 但能产生相同粘性末端的一类限制性核 酸内切酶 如 BamH I BclI BglII 和 Xho I 是一组同尾酶 注 意 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接 但是两种同尾酶消化产生的 粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别 五 限制性核酸内切酶的消化反应 一个限制酶单位 U 指 在理想的反应条件 适宜的缓冲液和反应温度 通常为 37 下 1h 内中完全降解 1 mg l DNA 所需要的酶量 影响酶活性的因素很多 最重要的有 DNA 的纯度 DNA 的甲基化程度 酶切反应的温度 通常为 37 DNA 的分子结构 核酸内切限制酶的缓冲液 在 非最适的 反应条件下 有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生 松动 从 其 正确 识别序列以外的其它位点切割 DNA 分子 这种现象叫星号活性 用 表示 二 DNA 连接酶及其应用 一 DNA 连接酶的发现 环形 DNA 分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在 首个 DNA 连接酶 ligase 大肠杆菌 DNA 连接酶 是 1967 年发现的 是大肠杆菌 基因编码 1970 年 发现了 T4DNA 连接酶 由大肠杆菌 T4 噬菌体基因编码的 二 DNA 连接酶作用特点 1 连接的两条链必须分别具有自由 3 OH 和 5 P 而且这两个基团彼此相邻 2 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程 E coli DNA 连接酶 连接具互补碱基黏性末端 最初研究表明 现在研究可连接平末 端 需 NAD 辅助因子 活性低 不常用 T 4DNA 连接酶 连接具互补碱基黏性末端和平末端 需 ATP 辅助因子 活性高 常 用 三 DNA 连接酶的反应条件 影响连接效率的因素有 1 温度 通常在 4 15 2 ATP 的浓度 10 M L 1mM L 3 连接酶浓度 一般平末端大约需 1 2U 黏性末端仅需 0 1U 4 反应时间 通常连接过夜 5 插入片段和载体片段的摩尔比 1 1 5 1 四 T4 DNA 连接酶对目的 DNA 片段和载体连接的一般方案 1 连接反应一般在灭菌的 0 5ml 离心管中进行 2 10 l 体积反应体系中 取载体 50 100ng 加入一定比例的外源 DNA 分子 一般线 性载体 DNA 分子与外源 DNA 分子摩尔数为 1 1 5 1 补足 ddH2O 至 8 l 3 轻轻混匀 稍加离心 56 水浴 5min 后 迅速转入冰浴 4 加入含 ATP 的 10 Buffer 1 l T4 DNA 连接酶合适单位 用 ddH2O 补至 10 l 稍加离心 在适当温度 一般 14 16 连接 8 14hr 三 DNA 聚合酶及其应用 一 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 是 Kornberg A 1956 年首先从大肠杆菌 E Coli 细胞中分离出来的 它是一种多功能 性的酶 包括 3 种不同的酶活力 5 3 聚合酶活性 模板 带 3 OH 游离基团的引物 4dNTPs Mg2 双链特异性的 5 3 核酸外切酶活性 3 5 核酸外切酶活性 从游离的双链或单链 DNA 的 3 端降解 不过对于双链的降解可被 5 3 的多聚活性所 抑制 主要是校正作用 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的三种用途 1 利用缺口转移法制备高比活度的 DNA 探针 利用其 5 3 的外切酶活性及其聚合酶活性 2 用于 DNA 连接前的大缺口填充 利用 5 3 的聚合酶活性 3 用于 DNA 的序列分析 利用 5 3 的聚合酶活性 二 Klenow 片段酶 Klenow 片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子 分子量为 76KD 酶催活性 5 3 的聚合酶活性 3 5 的核酸外切酶活性 Klenow 片段的主要用途 利用 5 3 的聚合酶活性 修补限制性酶消化 DNA 形成的 3 隐蔽末端 标记 DNA 片段的末端 底物用 32P dNTPs cDNA 克隆中第二链 cDNA 的合成 DNA 序列的测定 三 T4 DNA 聚合酶 T4DNA 聚合酶是从 T4 噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的 1 酶催活性 5 3 的聚合酶活性 3 5 的核酸外切酶活性 其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高 200 倍 比 Klenow 片段酶强 100 1 000 倍 因此 可以综合利用这两种活性进行取代合成反应 如果反应体系中仅存在一种 dNTP 或没有底物时 这时 T4DNA 聚合酶就会表现出 3 5 外切酶活力 从双链 DNA 的 3 开始降解 直到露出底物 dNTP 相同的碱基 然后就 在此位置发生合成和取代反应 2 T4DNA 聚合酶的用途 1 利用取代合成反应制备探针 2 标记具有平末端的或具有 3 隐蔽末端的 DNA 片段 利用较强的 3 5 外切酶活性和 5 3 聚合活性 3 用于 DNA 序列分析 四 逆转录酶 反转录酶 逆转录酶 是一种依赖 RNA 的 DNA 聚合酶 此酶首先是 1970 年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的 这两个课题组的论文都 发在了同一期的 Nature 杂志上 最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒 AMV 分离出来的 活性 一种可以有效地将 mRNA 反转录成 DNA 的酶 其产物称为 cDNA complementary DNA 主要用途是 将 mRNA 转录成 cDNA 以制备基因片段 四 修饰性工具酶 一 末端转移酶 terminal transferase l 末端转移酶是一类不依赖于 DNA 模板的 DNA 聚合酶 l 特性 该类酶可以在没有模板链存在的情况下 将核苷酸连接到 dsDNA 或 ssDNA 的在 3 OH 特别是对于平末端的双链 DNA 末端加尾十分有用 l 最常见的用途 给外源 DNA 片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴 以创造黏性末 端 便于重组 二 SI 核酸酶 SI nuclease 这是一种从米曲霉 Aspergillus oryzae 中分离的高度单链特异的外切酶 活性 可以降解单链 DNA 或 RNA 或双链的单链区 其主要用途有 在 cDNA 合成过程中 切开 cDNA 的发夹末端 载体构建过程中 切去 DNA 片段的单链尾巴 形成平末端结构 三 碱性磷酸酶 从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶 Bacterial Alkaline Phosph