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血清学肝纤维化四项指标的应用 目录 肝纤维化简述肝纤维化诊断方法肝纤四项指标的应用肝纤四项检测方法的发展安图生物肝纤四项产品应用常见问题 肝纤维化简述 定义 肝纤维化 hepaticfibrosis 是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时 肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程 肝纤维化是慢性肝病的共同病理学基础 随着各种不同的慢性肝脏疾病的进展可逐渐形成肝纤维化 引起肝纤维化的病因消除后 早期肝纤维化可完全恢复 肝硬化则不易复原 肝纤维化简述 定义 需要认识 注意和区别的是 1 肝纤维化既是一种病理状态 又是一组临床和病理学的综合征 2 肝纤维化是一种主动性过程 3 创伤修复与损害的双重因素 4 与肝纤维化增生性疾病 肝硬化的区别 轻 肝纤维化重 肝硬化 不同之处 肝小叶结构是否完整 肝纤维化的研究经历了漫长的时期 大致可归纳为三个历史阶段 1 2O世纪6O年代前 为形态学描述研究时期 dis eriptiveperoid 主要为肝脏结缔组织含量增加的大体病理改变 结缔组织观察限于不溶性纤维 被认为是一种稳定的无活力的结构 肝纤维化简述 研究历史 2 20世纪60 80年代初 为生理研究时期 physi ologicperiod 研究涉及结缔组织成分的理化性 免疫性 超微结构 ECM的形成与降解 细胞间相互作用 细胞因子的作用等方面 此阶疑的研究主要为动物实验及细胞培养系统的观察 且大多为定性观察 此期间有几次国际肝纤维化学术会议 其中较有影响的如1973年在德国Freiburg召开的肝脏的胶原代谢会议 1979年在意大利Fuggi召开的肝纤维化免疫病理研讨会及1980年在德国Munster召开的人类正常肝脏和纤维化肝脏的结缔组织研讨会等 肝纤维化简述 研究历史 3 20世纪80年代后 为动力学研究时期 kineticperiod 已步入活体研究 并在细胞和分子水平进行定量改变观察 其中涉及到肝纤维化形成的网络学说及其反馈调节系统 相关基因表达及其改变 肝星状细胞 HSC 在肝纤维化过程中作为主要效应细胞及其转化 人体肝纤维化疾病的多领域协同研究等 此期间 除1985年在日本Matsue召开的肝纤维化的病理和生物学 1989年在美国California召开的结缔组织生物学和肝脏的学术会议外 在许多国家或国际消化系统疾病和肝脏疾病学术会议中 都把肝纤维化列为专题进行交流研讨 可见有关肝纤维化的研究已受到普遍的关注和重视 肝纤维化简述 研究历史 1 单核 巨噬细胞在肝纤维化的启动阶段 Kupfer细胞受到刺激激活 释放大量的细胞因子 如转化生长因子 TGF TGF 肿瘤坏死因子 TNF 白细胞介素 1 IL 1 血小板衍生因子 PDGF 中性粒细胞趋化因子 CINC 和集落刺激因子 CSF 等 这些均可激活肝星状细胞 HSC 使其转化为肌成纤维细胞 同时通过旁分泌和自分泌作用 使HSC增殖 合成大量的细胞外基质 ECM ECM分泌增加 降解减少 因而在肝内大量沉积 肝纤维化逐渐形成 肝纤维化简述 肝纤维化的形成机制 2 MMP和TIMP由于近年来肝纤维化机制研究取得进展 细胞外基质分解酶即基质金属蛋白酶 MMP 以及金属蛋白酶组织抑制剂 tissueinhibitorofmetalloprotein ases TIMP 的重要性逐渐引起人们的重视 MMP是一组金属依赖性蛋白酶 以细胞外基质蛋白为其作用的主要底物 其作用是降解肝细胞外基质 肝损伤早期 MMPs中的明胶酶A MMP2 明胶酶B MMP9 和基质分解素 MMP3 降解正常的基底膜 使星状细胞失去正常的由 型胶原 层粘蛋白和蛋白多糖构成的基质环境 无法保持静止状态 激活的星状细胞大量增殖产生大量细胞外基质 MMP通过尿激酶纤溶酶原 uPA 水解激活 而PAI 1为其主要负向调节因子 它可阻止纤溶酶原转化为纤溶酶 从而使MMP不能被激活 而TIMP作为MMP抑制剂 即使MMP被激活状态 也可被抑制 在肝损伤后 TIMP 1和TIMP 2的表达开始迅速而显著地增加 并且保持持续增加 其作用是抑制MMPs的表达 从而抑制细胞外基质降解 肝纤维化简述 肝纤维化的形成机制 从生理角度看 肝损伤时肝内纤维结缔组织增生是一种对损伤的正常修复反应 肝小叶结构紊乱 肝细胞数量减少 肝功能降低过度增生肝脏萎缩变硬 肝硬化失代偿肝纤维化是慢性肝病最重要的病理特征 也是慢性肝炎 肝硬化进一步发展 恶化的重要原因 肝纤维化简述 肝纤维化的病理生理学 慢性乙型肝炎慢性丙型肝炎血吸虫病脂肪性肝炎 酒精或非酒精性 药物免疫性肝病胆汁淤积等 肝纤维化简述 肝纤维化的病因 肝纤维化简述 肝纤维化的发病率 据统计 目前我国乙肝病毒携带者1 2亿 慢性乙肝患者约3500万 加上慢性丙肝 血吸虫病 免疫性肝病等 构成了庞大的潜在的肝纤维化患者群 绝大多数存在肝纤维化 其中25 40 最终发展成为肝硬化乃至肝癌 调查显示 肝硬化占据国际上疾病死亡病因的第六位 此外 我国30岁至40岁的中青年男性中 四分之一被确诊患有脂肪肝 肥胖人群 经常失眠 疲劳 不思茶饭和嗜酒者是脂肪肝高发人群 此类人群的肝纤维化发病率为20 30 肝纤维化简述 推行肝纤维化诊断的意义 引起肝纤维化的病因消除后 早期肝纤维化可完全恢复 肝硬化则不易复原 因此 早期发现并积极治疗肝纤维化 使之逆转或延缓其发展 对提高患者生活质量 改善患者预后 有十分重要的作用 肝纤维化诊断方法 肝纤维化的形成与发展是一种动态的病理过程 形态学改变伴同的肝内循环 代谢和其他功能改变 使其表现成广谱的临床病理综合征 肝纤维化的诊断涉及对病原学 流行病学 临床 生化学 影像学及组织病理学等各方面的评定 1 综合判断 肝纤维化是一种病理状态 又是一组临床和病理学的综合征 其诊断有赖于组织学检查 须临床与病理相结合 才能完善诊断 临床上肝纤维化的诊断须通过一系列的检查予以综合判断 包括临床评估 病原学 组织病理学 体液中肝纤维化标志物和影像学检查等 正常诊断并判定纤维化的阶段和活动程度 对肝纤维化的防治及其预后的估计都将起积极作用 2 临床评估 1 病史 肝纤维化患者常有病毒性肝炎 饮酒 血吸虫病 胆汁淤积或胆道疾病等病史 遗传性和代谢性疾病等家族史 但许多遗传性肝病是常染色体隐性遗传 因而难以确认受累家族的有关成员 2 病程 年龄及性别 肝脏炎症性疾病的病程持续6个月或以上者 定为慢性肝炎 不同年龄阶段对慢性肝炎的分级及分期可能有影响 存在着随年龄增长伴纤维化程度增加的趋势 对慢性丙型肝炎肝纤维化进程自然史的观察发现 感染时年龄超过40岁及男性 可作为两个独立的因素与纤维化发病率的升高相关 3 临床表现 肝纤维化患者可以无症状 且有症状大多也为非特异性 因临床表现不典型常易被忽略 近年来采用量级化观察 将症状和体征的轻重程度 数量多寡进行综合计分 这种临床评估被认为是肝纤维化非创伤性评定的组成部分 有助于提供一些有关肝纤维化严重性的线索 肝纤维化的临床表现大致有3个范畴 1 临床慢性肝炎表现 可分为有症状型和无症状型 黄疸型和无黄疸型 2 门脉高压症 3 伴同于原发病的其它临床综合征 3 组织病理学诊断及其评估 3 1组织学诊断方法3 1 1常规及广义的组织学检查 通常用于肝纤维诊断的金标准是指常规病理学检查 通过对肝活检标本连续切片 常规苏木精2伊红 网状纤维和 或 Masson三色染色 判断结构 炎症和纤维化改变 病变分为轻 中 重三种程度评估 广义的组织学检查还包括电镜 特殊染色 计算机图像分析 组织化学 免疫组化 原位分子杂交 原位PCR 酶学 重金属含量测定等 以进一步满足基础和临床研究以及评估药物治疗效果的需要 3 组织病理学诊断及其评估 3 1 2组织学半定量评估系统 依据对肝纤维化的分布 纤维化的形式及数量改变参数进行量化评估 目前有若干个半定量积分系统用于评估肝纤维化的分期 F 3 1 2 1慢性肝炎的分级分期标准 有多个系统用于评估慢性肝炎的病理改变 一般采用的是以Scheuer等方案为基础进行分级和分期 我国学者也以此为基础修订了慢性肝炎的病理诊断标准 近来提出以病原学为基础的慢性肝炎新分类建议 因此废弃慢性迁延性肝炎 慢性活动性肝炎及慢性小叶性肝炎等诊断命名 因为它们不是不同的疾病类型 在整个病程中是可以互相转变的 慢性肝炎的诊断需包括病原 分级和分期3个部分 分级是依据坏死和炎症的程度 评估病变的活动程度 分期是依据纤维化的程度和肝硬化的形成 表示疾病的进展情况 与病程有关 并影响治疗及预后 最后的诊断命名如慢性乙型肝炎 中度活动 明显纤维化 自身免疫性肝炎 明显活动 肝硬化 慢性药物性肝炎 明显活动 无纤维化等 3 组织病理学诊断及其评估 3 1 2 2其他几种肝纤维化分期半定量评估系统简介 表1列出的4个评估系统相互之间有较好的关联性 它们都重视纤维隔形成和桥接纤维化的出现对病变进程的判断意义 组织学分期按F0 F4区分 F0和F1反映轻度纤维化 F2和F3为中度纤维化 F4为重度纤维化 近年来临床病理联系中普遍注重分期诊断中判别有无明显纤维化的意义 以F0 1表示无明显纤维化 而以纤维隔或桥接纤维化的出现 即Scheuer和METAVIR F2或Ishak F3定为临床明显纤维化 CSF 因此 评估F2与F3之间的纤维化进展较F1与F2之间的进展显得更为重要 3 组织病理学诊断及其评估 3 2组织学诊断的局限性3 2 1创伤性检查的限制性 不易被患者接受 约0 3 发生肝穿刺后严重合并症 难反复活检 3 2 2病变和评估系统的影响 肝纤维化的不均匀性分布常导致组织学评估错误 非酒精性脂肪性肝炎 NASH 的纤维化不均匀性较慢性丙型肝炎 CHC 明显 这与肝脏不同区域肝实质损伤后愈合的差异有关 慢性肝病 CLD 的炎症活动性病理分级诊断准确性 DA 一般都相对高于纤维化的分期诊断 分级诊断可仅误差1级 而分期 F3和F4 可误差1 2期别 应用METAVIR系统评估肝脏左右叶之间的炎症和纤维化可发现炎症分级至少差异1级者为24 而纤维化分期至少差异1期者为33 Siddique等用Knodell系统评估肝右叶同一穿刺部位的2次标本 发现肝纤维化评估差异1期者高达45 3 2 3标本差异 传统的合适肝活检标本指长度1 5cm并含4 5个汇管区 近来普遍不能接受此标准 应用半定量系统评估肝纤维化的标本长度应 2 2 5cm 宽度 1 2 1 4mm 含11 15个汇管区 METAVIR系统标本长度至少2 5cm Ishak系统标本长度至少2 0cm 宽度1 4mm 含至少11个汇管区 肝活检获取的2cm肝组织仅是整个肝脏的5万分之一 标本太小可出现纤维化分期低估 肝硬化的漏诊可达15 30 标本长度不够和标本破碎造成的标本错误是病理诊断失败的常见原因 由其引起的分级和分期假阴性分别占10 1 和4 5 主要与标本太小有关 而纤维化分期的假阳性发生率3 5 则主要与标本破碎有关 肝脏表面锲形活检标本也可能给诊断带来假象 正常肝包膜下纤维组织丰富 在低氧 缺血或免疫介导的肝损伤时 肝包膜下病变受累更明显 易误诊肝纤维化或肝硬化 故疑弥漫性肝病时 应建议外科医师作肝组织锲形活检同时进行针穿 3 组织病理学诊断及其评估 3 2 4观察者差异 组织学分析活检标本需有经验和技能 但仍然存在主观倾向 易在观察者内和观察者间产生差异 肝脏病理学家对纤维化分期诊断在观察者内的一致性为60 90 在观察者间的一致性高于70 90 应用METAVIR系统评估的一致性高于Ishak系统 Afdhal等认为 即使有经验的临床医师做肝活检和有资历的病理学家解释标本 纤维化分期错误率仍达20 分期或肝硬化的正确诊断率约80 3 组织病理学诊断及其评估 4 肝纤维化的影像学诊断 由于近代医学影像技术的不断发展 如超声波 计算机X线断层扫描 CT 核磁共振 MRI 核素扫描 纤维内镜及腹腔镜等 广泛用于临床 各种影像检查及检查方法互为补充 大大提高了对肝脏疾病的诊断水平 就目前来看 作为肝纤维化的影像学诊断仍以B超较为常见 但尚未有比较敏感和特异的指标 近来上海市肝纤维化课题协作组研究发现 B超检查如果发现肝包膜厚度 肝右叶最大斜径 门静脉主干管径 门静脉左支管径 门静脉右支管径 胆囊壁厚 脾长径 脾厚度 脾静脉直径 门静脉每发钟血流量参数 光点形状和胆囊形态等有变化时 常常提示已出现肝纤维化 这些指标可作为判断肝纤维化较有用的指标 而CT MRI仅发现肝包膜和脾脏体积与肝纤维化有关 提示B超较CT MRI在肝纤维化诊断中似乎有更大的价值 5 血清学标志物 就临床应用而言 理想的标志物应对肝脏具有高度特异性 灵敏性和准确性 具有良好的重复性 易于测定且为非侵入性 目前应用于研究和 或临床的体液中肝纤维化的标志物为血清标志物 小部分为尿液标志物 在肝纤维化非创伤性诊断评价中 有多个具有潜在诊断价值的标志物 包括ECM成分 降解产物 参与它们代谢的酶及细胞因子等 一些有价值的标志物也包括在免疫功能及常规肝功能检查中 1 胶原蛋白 胶原蛋白在正常肝脏中约占蛋白重量的5 10 肝纤维化时胶原蛋白含量可增至50 左右 目前发现肝内胶原蛋白主要有5种 分别是 和 型胶原 其中以 型为主 肝纤维化时 型胶原的增加最为明显 2 糖蛋白 包括层粘连蛋白 LN 纤维连接蛋白 FN 和其受体 FNR 等 3 蛋白多糖 主要是透明质酸 HA 肝硬化时肝内可有大量HA合成 血清HA水平在判定肝纤维化或活动性硬化性疾病时更为敏感 HA在目前所有肝纤维化血清学指标中是诊断价值最高的一个 5 血清学标志物 4 胶原代谢相关酶类 脯氨酸羟化酶 PH 和脯氨酸肽酶 PLD 水平升高主要与肝纤维化活动性有关 基质金属蛋白酶 MMPs 和其抑制物 TIMPs 在肝纤维化过程中起着非常重要的作用 有研究指出 血清TIMP 1诊断肝纤维化的敏感性为69 特异性为72 血清中TIMP 1水平能很好反映肝纤维化活动度 对判断肝纤维化预后有很大价值 最近研究发现慢性肝炎患者血清MMP 2 TIMP 1比值 TIMP 1水平均与肝组织炎症程度相关 但只有MMP 2 TIMP 1比值与肝纤维化分期相关性 MMPs和TIMPs在肝脏诊断中的意义需要进一步研究 5 细胞因子 细胞因子在肝纤维化形成中具有重要作用 肝纤维化时血清中与肝纤维化密切相关的细胞因子有IFN TGF 1和PDGF等 6 肝功能指标 某些肝功能指标可用于肝纤维化的无创伤性诊断 常用的有白蛋白 A 白 球蛋白 A G 比例 GGT 巨球蛋白 MG 和载脂蛋白A1 ApoA1 等 肝纤维化诊断方法的比较 肝纤四项指标的应用 1 肝纤四项指标简介1 1透明质酸 透明质酸 hyaluronicacid HA 广泛分布于细胞外间隙 是一由重复的二糖单位组成的线状多聚体 分子量为10 10000kd HA主要由组织中纤维母细胞合成 通过淋巴系统进入血循环 并由肝脏快速清除 肝内皮细胞是HA摄取 降解的场所 HA在循环中的半衰期是2 5 5 5min 由于体内存在有效的HA清除机制 因此 正常人血清中仅有低水平的HA 多种原因导致的肝病均可使血清HA水平上升 主要与肝脏清除功能下降 肝脏内成纤维细胞 肝星状细胞 合成增加有关 在肝纤维化时 肝星状细胞合成HA水平大大升高 且内皮细胞清除HA能力亦有下降 双重原因导致肝纤维化中HA水平上升 1 肝纤四项指标简介 根据文献可以发现血清HA水平具有以下作用 反映肝脏纤维化形成 反映肝脏纤维化程度 反映肝细胞功能 反映肝脏炎症性改变 无论是无症状性病毒感染或严重病毒感染 酒精性肝病 胆汁性肝硬化 HA均是有效指标 可用于药物疗效观察及病情的动态观察 就目前的临床研究而言 HA是目前众多纤维化生化指标中最为敏感和特异的指标 80 以上 若与其他指标联合应用 其诊断敏感度和特异性可进一步提高 有报道 在慢性肝病肝纤维化组织学一血清学对照研究中发现 HA是4项细胞外间质成分 HA P NP IV型胶原 层粘蛋白 中最为敏感和特异的指标 HA的诊断准确性为82 9 特异性为93 敏感性为56 1 肝纤四项指标简介 1 2层粘连蛋白 LN LN是基底膜成分中的主要大分子糖蛋白 在肝内与 型共同分布 大量沉积则引起肝窦毛细血管化 直接影响肝窦血流阻力 血清LN的测定通常是测定其LN P1片段 即抗胰酶片段 因此 LN P1主要反映的是肝纤维化形成中的纤维化活性 其血清值被认为是反映基底膜更新率的指标 可提示肝窦的毛细血管化和汇管区纤维化 但LN在肝纤维化中的诊断价值与肝纤维化形成的病因密切相关 研究表明 LN水平在酒精性肝硬化明显高于病毒性肝硬化和胆汁性肝硬化 LN水平可反映酒精性肝病是否存在门脉高压及门脉高压程度 但在非酒精性肝硬化 LN则不能用于门脉高压的诊断 总之目前有关LN对诊断肝纤维化的价值仍有争议 其诊断敏感性不及 型胶原和P NP 与其他标志物一样 LN也缺乏高特异性 故应与其他指标联合检测 有学者认为 P NP反映慢性肝纤维化的活动性 早期即显著升高 LN与纤维化程度和门脉高压正相关 纤维化后期升高尤为显著 透明质酸反映肝脏损伤程度 可明确区别早 晚期肝纤维化 因此3者联合检测对肝纤维化的诊断有实用价值 1 肝纤四项指标简介 1 3 型前胶原氨基端肽 P NP P P 血清P NP是 型前胶原在细胞外形成原胶原前 被相关酶切下后进入血循环的氨基端尾肽 完整的前 型胶原肽主要由肝脏通过窦状隙内皮细胞受体介导的内吞作用被清除 而小片段则主要由肾脏排泄清除 故胶原代谢活跃及肝功能损伤时 血清P NP增高 P NP被视为肝纤维化生成的血清学指标 P NP在肝纤维化病人血清中水平的上升与组织学上的表现 如炎症和纤维化的活动程度有伴随关系 测定P NP的含量可以有效地区别轻型与中 重型慢性肝炎 提示活动性肝纤维化 是反映慢性肝纤维化活动性和程度的指标 长期随访血清P NP含量能判定慢性肝病的预后 对原发性胆汁性肝硬化 慢性迁延性肝炎 慢性活动性肝炎 自身免疫性肝炎进行2 10年随访 无论药物治疗与否 原发性肝硬化者血清P NP总是升高 接受肝移植后 P NP含量降至正 慢性迁延性肝炎P NP含量在正常上限 发展成肝硬化的慢性活动性肝炎其血清P NP水平持续升高 转入缓解期则血清P NP值正常 唯自身免疫性肝炎例外 血清值一直不高 综上所述 血清P NP可评估慢性肝病 特别是慢性活动性肝炎纤维化过程 其临床判断预后价值已被公认 但总体敏感性 特异性不高 1 肝纤四项指标简介 1 4 型胶原 型胶原是构成基底膜的主要成分 肝纤维化时肝内 型胶原合成增多并大量沉积 致使肝窦毛细血管化 组织中的 型胶原是以原胶原形式交联组成三维网状结构而存在的 故其网状结构中不仅含 型胶原的主三螺旋区 也含其氨基端的四聚体 P NP 7s胶原 和羧基端的二聚体 P CP NCL 故 型胶原有3种可检测成分 即血清7S胶原 NCL及主三螺旋区 3者均是反映 型胶原降解的指标 即具有相同的临床意义 差别在于不同成分的检测敏感度不同 由于胶原降解的增加常伴有更多的再合成 因此 确切地说 他们是反映基底膜胶原更新率的指标 研究表明 型胶原成分的检测对判断肝纤维化和硬化具有较高的敏感性 79 和特异性 82 近来有文献报道在慢性活动性丙肝患者中组合利用 型胶原与凝血酶原时间 PT 可较为明确地诊断为肝硬化 目前认为 型胶原是反映活动性肝纤维化的较好指标并倾向于将该指标与其他指标联合应用以提高判断的敏感性 2 肝纤四项指标的联合检测 李漫松等通过对220例肝病患者血清IV型胶原 透明质酸及层粘连蛋白检测 结果显示各类肝病患者血清IV C HA LN水平随着病情进展而逐渐升高 以IV C 130 g L HA 260 g L LN 160 g L为诊断肝纤维化的临界点 其敏感度 特异度 准确率分别达80 以上 联合检测以IV C HA联合较为理想 说明三者可作为肝纤维化诊断较为敏感的指标 其中IV C对早期肝纤维化的诊断优于HA LN 李琴等通过对69例慢性肝病患者的血清HA