杀菌率试验规程

Q KM ZJ 2008 液体洗涤剂杀菌试验规程 内部使用 2008年月日内部执行 质量管理中心实验室 引用标准 1 GB15979 2002 一次性使用卫生用品卫生标准 2 QB T2738 2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法 3 QB T2850 2007抗菌抑菌型洗涤剂 4 2002 年版 消毒技术规范 中华人民共和国卫生部 5 2001 年版 药品微生物学检验手册 科技出版社 杀菌率试验规程 1 试验菌 试验温度 作用时间 试液浓度 试验菌种 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 大肠杆菌 8099 或 ATCC 25922 白色念珠菌 试验温度 20 1 作用时间 最短不得小于 30s 常规作用时间为2min 5min 10min 20min 试液浓度 中和剂鉴定用试液浓度应为正式杀菌试验最高浓度 菌悬液用量 正式 杀菌试验 用菌悬液的浓度 取量应与 中和剂鉴定中 1 组 2 组所用 菌悬液的浓度 取量相同 2 细菌繁殖体悬液 菌片的制备程序 2 1 菌悬液的制备 取冻干菌种管 在无菌操作下 以毛细吸管加入适量营养肉汤 轻柔吸吹数次 使菌种融化分散 取含 5 0ml 10 0ml营养肉汤培养基试管 滴入少许菌种悬液 置37 培养 18h 24h 用接种环取第1 代培养的菌悬液 划线于营养琼脂培养基平板上 于37 培养 18h 24h 挑取上述第2 代培养物中典 型菌落 接种于营养琼脂斜面 于37 培养 18h 24h 即为第 3 代培养物 放在 4 左右冰箱中保藏 每隔 2 3 个月移种一次 继续保藏 取第 3 代 14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物 经18h 24h 培养 用 5 0ml 吸管吸取 3 0ml 5 0ml稀释液加入斜面试管内 反复吹吸 洗下菌苔 随后 用5 0ml 吸管将洗液移至另一无菌 试管中 在手掌上振敲80 次 力度适中 勿溅出 以使细菌悬液均匀 或从新鲜菌种斜面沾取少量菌 苔 接种在适合试验菌生长的培养基中 37 培养 18h 24h 或适宜时间 作为原菌液 源于 药品 微生 物学检验手册 211 页 细菌繁殖体悬液应保存在4 冰箱备用 尽量减少在室温下放置时间 以减少细菌的自然死亡 应当 天使用不得过夜 44 回收菌数为 1 10 9 10cfu ml用 PBS 液配置GB15979 2002 一次性使用卫生用品卫生标准 回收菌数为1 10 8 5 108cfu ml 用 TSB 营养肉汤配置 2002 消毒技术规范 2 2 菌片的制备程序 消毒技术规范 取冻干菌种管 在无菌操作下 以毛细吸管加入适量营养肉汤 轻柔吸吹数次 使菌种融化分散 取含 5 0ml 10 0ml营养肉汤培养基试管 滴入少许菌种悬液 置37 培养 18h 24h 用接种环取第1 代培养的菌悬液 划线于营养琼脂培养基平板上 于37 培养 18h 24h 挑取上述第2 代培养物中典 型菌落 接种于营养琼脂斜面 于37 培养 18h 24h 即为第 3 代培养物 取第 3 代 14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物 经18h 24h 培养 用 5 0ml 吸管吸取 3 0ml 5 0ml TSB 营养肉汤 加入斜面试管内 反复吹吸 洗下菌苔 随后 用 5 0ml 吸管将洗液移至另一 无菌试管中 在手掌上振敲80 次 以使细菌悬液均匀 含菌量1 10 8 5 108cfu ml 用无菌镊子夹住已灭菌10mm 10mm 滤纸一角 一面朝上 注入10ul 菌悬液 放到无菌平板内 37 温箱中干燥 20min 30min 或在室温自然阴干后使用 制成菌片 每个菌片回收菌落 按活菌培养计数 所 得结果 应为5 105 5 106 cfu 片 细菌繁殖体悬液和菌片 用毕应随时保存在4 冰箱内 尽量减少在室温下放置时间 以减少细菌的 自然死亡 应当天使用不得过夜 3 操作程序 3 1 悬液定量法杀菌试验操作程序 样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂鉴定用试液浓度 或低于中和剂鉴定用试液浓度 制成 稀释 液 试验样液 将试管按需要数量分别排列于试管架上 各组由左向右 排序 标记 44 配制菌悬液 浓度为1 10 9 10cfu ml GB15979 2002 一次性使用卫生用品卫生标准 或1 88 10 5 10 cfu ml 2002 消毒技术规范 取杀菌试验用无菌大试管 先加入0 5ml 试验用菌悬液 再加入0 5ml 有机干扰物质 混匀 置 20 1 5min 用无菌吸管吸取步骤1 中的试验样液 4 0ml 注入其中 立即开启计时器 并迅速混匀 在 手掌上振摇 80 次 见 消毒技术规范 或吸取试验用菌悬液0 1ml 加入到含 5ml 样液的试管中 立 即开启计时器 并迅速混匀 在手掌上振摇80 次 见 QB T 2738 2005 作用 2min 5min 10min 20min 即刻用无菌吸管吸取0 5ml 移入鉴定合格的 4 5ml 中和剂溶液 中 中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同 充分混匀 中和作用10min 后 取样液 10 倍 系列稀释液 0 5ml 见 GB15979 2002 或分别吸取 1 0 ml 见 消毒技术规范 见图四 置于 2 个灭菌平皿 用凉至40 45 营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基 酵母菌 15ml 作倾注 转动平皿 使其充分均匀 琼脂凝固后翻转平板 35 2 培养 48h 细菌 或 酵母菌 25 2 培养 72h 作活菌菌落计数 同时用稀释液代替样液进行平行试验 作为阳性对照管 阴性对照组 分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养 观察有无污染 计数菌落时 一般以肉眼观察 必要时用放大镜检查 以菌落数在 15cfu 300cfu 的平板为准 每 个稀 释度 3 个平板生长菌落数全部合乎上述标准 则以该 3 个平板的菌落平均值作为结果 若有 2 个符 合合乎上 述标准 则以该合格的 2 个平板菌落的平均值作为结果 试验重复 3 次 求其平均值 根据各组活菌浓度 cfu ml 计算杀菌率 见计算公式1 或根据 各组活菌浓度换算为对数值 N 计算杀灭对数值 见计算公式2 3 2 载体法杀菌试验操作程序 试验样品用无菌标准硬水 过滤除菌 稀释至规定浓度 制成 稀释液 试验样液 吸取样液 5 0ml 放入灭菌平皿 另吸取PBS 5 0ml 注入平皿中 作为阳性对照皿 每皿用无菌镊子 夹住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿 作用至设定时间后 即刻用无菌镊子夹住菌片一角 投入含5 0ml 中和剂的试管中 中和剂的浓度 与容量应与鉴定试验结果规定的相同 充分混匀计时 见图三 中和 10min 后 取样液或 10 倍系列稀释液 1 0ml 见图四 置于两个灭菌平皿 接种凉至 40 45 营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基 酵母菌 15ml 转动平皿 10 20 下 使其充分均匀 凝固 后 于 35 2 培养 48h 细菌 或 72h 酵母菌 作活菌菌落计数 试验重复 3 次 求其平均值 阴性对照组 分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养 观察有无污染 A PBC 液 0 03mol L 磷酸盐缓冲液 B 无菌标准硬水 1ml 置于灭菌平皿内 C 空白平皿 倾注营养琼脂培养基 细菌 或沙氏琼脂培养基 酵母菌 15ml 培养 计数菌落时 一般以肉眼观察 必要时用放大镜检查 以菌落数在 15cfu 300cfu 的平板为准 每 个稀 释度 3 个平板生长菌落数全部合乎上述标准 则以该 3 个平板的菌落平均值作为结果 若有 2 个符 合合乎上 述标准 则以该合格的 2 个平板菌落的平均值作为结果 4 计算公式 1 杀菌率 X1 A B A 100 式中 X1 杀菌率 A 对照样品平均菌落数 B 被试样品平均菌落数 2 杀灭对数值 KL 对照组平均活菌浓度的对数值 No 试验组活菌浓度的对数值 Nx 备注 计算杀灭对数值时 取小数点后两位值 可以进行数字修约 如果消毒试验组消毒处理后平 均生产菌落数 小于等于1 时 即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值 5 评价标准 杀菌率 90 产品有杀菌作用 悬液定量杀灭试验中 各次的杀灭对数 值 5 00 可判定为消毒合格 6 操作要点 消毒技术规范2002 版 1 对接触消毒剂 杀菌剂 的样本 在达到规定作用时间 即刻取样移入鉴定合格的中和剂 溶液中 中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同 2 即刻混匀 并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测 3 在将样本接种培养基以前的操作 应按规定时间内进行 以免微生物与中和剂或中和产物 接触过久 审核 编制 中和剂悬液定量鉴定试验操作程序 引用标准 QB T2738 2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法 试验菌悬液在1 104 9 104cfu ml 4 9 104 GB 15979 2002一次性使用卫生用品卫生标准 试验菌悬液在1 10 7 5 107 cfu ml 2002消毒技术规范 试验菌悬液在1 10 一 定义和术语 cfu ml 中和剂 在微生物杀灭试验中 试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时 用以中和残留的杀 菌剂 使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂 中和产物 中和剂加杀菌剂 样品 9 1 作用 10min 配置而成 二 中和剂鉴定试验原理 中和剂鉴定试验原理 试验分组第 1 组 杀菌剂 菌液 培养 第 2 组 杀菌剂 菌 液 中和剂 第 3 组 中和剂 菌液 培养 第 4 组 杀菌剂 中 和剂 菌液 第 5 组 阳性菌数对照 第 6 组 阴性对照 培养 培养 观察杀菌剂对观察残留杀菌观察中和剂是观察中和产阳性对照组 阴性对照组 试验菌有无杀剂被中和后 否抑菌 物 或未被完 灭或抑制能力受到杀菌剂作全中和的残留 试验目的 用后的试验菌杀菌剂对试验 是否能恢复生菌的生长繁殖 长 是否有影响 三 中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法 出现的问题解决方法 1 组无菌生长或 组平板上少于5 个菌 落 其它组正常 降低消毒剂浓度或缩短作用时间 2 菌落数较多且数量基本相同 其它组正 常 提高消毒剂浓度或延长作用时间 3 组中和剂菌落数明显少于PBS 组菌数降低中和剂浓度或改变中和剂成分 4 组 中和产物 菌落数明显少于 PBS 组菌数 其它组正常 提高中和剂浓度或改变中和剂成分 5多次更换中和剂均不能得到满意结果 选用载体法进行中和剂鉴定 杀菌试验同时用 载体法进行 四 1 鉴定试验操作程序 中和剂悬液定量鉴定试验操作程序 消毒技术规范 试验分组第 1 组第 2 组第 3 组第 4 组第 5 组第 6 组 取试验样品 4 0ml 加入各 对应组 取 4 5ml 中和 剂 加 入 对 应 组 取 4 9ml 中 和产物 b 加 入对应组 取 4 5ml PBS 稀释液 加 入对应 组 20 1 恒温 5min 菌悬液 1 0ml 菌悬液 1 0ml 0 1ml 菌悬液 0 4ml 硬水 混匀 0 1ml 菌悬 液 0 1ml 菌悬液 0 4ml 硬水 混 匀 振敲 80 次 混匀 作用至试验预定时间 取 0 5ml 加入下列对应组 作用 10min 取 0 5ml 加入下列各对应组 PBS 4 5ml 中和剂 4 5ml 中和剂 4 5ml 中和产物 4 5ml PBS 4 5ml 振敲 80 次 混 匀 作用 10min 取适宜稀释度悬 液 1 0ml 接种平 板 2 个 样本 活菌培养计 数 活菌培养计 数 用中和剂 10 倍系列稀释 用中和产物 10 倍系列稀 释 用稀释液 10 倍系列稀释 PBS 中和剂 各 1 0ml 接 种平板 cfu ml 第 1 组不长第 2 组菌数第 3 4 5 组菌数相似 第 6 组无菌 中和剂鉴定评 价规定 菌或明显少 于第 2 组 大于 5 且明 显少于第 3 4 5 组 误差率 15 生长 三组间平均菌数 第 3 4 5 组菌数 3 误差 率 三组平均菌数 各组菌落平均数 中和剂鉴定合 格标准中对 1 2 组菌数要求 0 5 X 1 10 X 5 Y 10 1 5 Y 的绝对值之和 3 三组间平均菌数 100 符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用 中和剂与试验样品的中 结论 和产物对指示菌无毒害 鉴定为该试验样品的中和剂 a 菌悬液浓度及制备 消毒技术规范 用 PBS 试验菌悬液在1 10 7 5 107 备注 b 中和产物的配置 先将试验样液1 0ml 与中和剂溶液 9ml 混合 作用 10min 后制成 四 2 鉴定试验操作程序 中和剂鉴定试验操作程序 载体法 试验分组 用无菌镊子取 菌片加入下列 第 1 组 吸取试验 样品 5 0ml 第 2 组 吸取试验样品 5 0ml 于无菌平 第 3 组 吸取中和剂 5 0ml 于无菌 第 4 组 吸取中和产 物 5 0ml 于 第 5 组 吸取 PBS 5 0ml 于无菌 第 6 组 对应组于无菌平皿内平皿内无菌平皿内平皿内 皿内 作用至预定时间 立即用无菌 镊子取出菌片移入对应组 混匀作用 10min 立即用无菌镊子取出菌片移入对应组 试管振打 80 次PBS 5 0ml 中和剂 5 0ml 中和剂 5 0ml 中和产物 5 0ml 稀释液 5 0ml 作用 10min作用 10min 取原液或稀释用稀释液用稀释液 10 倍用中和剂 10用中和产物用稀释液 10稀释液 液 1 0ml 接种 平板 2 个 样 10 倍系列 稀释 系列稀释倍系列稀释10 倍系列稀 释 倍系列稀释中和剂 各 1 0ml 本 接种平板 操作要点即刻混匀 并按规定时间接种培养基 cfu ml 中和剂鉴定评价 第 1 组不第 2 组有且较第第 3 4 5 组菌数相似 且其误差率 15 第 6 组无 评价规定 长菌或明 显少于第 2 组 1 组为多 较第 3 4 5 组为少 的菌数生长 并 三组间平均菌数 第 3 4 5 组菌数 3 菌生长 中和剂鉴定合 格标准中对 1 2 组菌数要求 符合下表要求 0 5 X 1 10 X 5 Y 10 1 5 Y 误差率 三组平均菌数 各组菌落平均 数 的绝对值之和 3 三组间平均菌数 100 符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用 中和剂与试验样品的中 结论 和产物对指示菌无毒害 鉴定为该试验样品的中和剂 a 菌悬液浓度及制备 用 PBS 将指示菌制成1 10 4 9 104 cfu ml 悬液 GB15979 备注 消毒技术规范用 PBS 试验菌悬液在1 107 5 107 b 中和产物的配置 先将试验样液1 0ml 与中和剂溶液 9ml 混合 作用 10min 后制成 四 3 鉴定试验操作程序 中和剂悬液定量鉴定试验操作程序 GB T 15979 试验分组第 1 组第 2 组第 3 组第 4 组第 5 组第 6 组 取 0 10ml 菌悬取试验样品 5 0ml 加入各取 5 0ml 中和取 5 0ml 中取 5 0ml PBS 液 分别加入各 组 对应组剂 加 入 对 应 组 和产物 b 加 入对应组 稀释液 加 入对应组 振敲 80 次 混匀 作用至试验预定时间 取 0 5ml 加入下列对应组 作用 10min 取 0 5ml 加入下列各对应组 PBS 4 5ml 中和剂 4 5ml 中和剂 4 5ml 中和产物 4 5ml PBS 4 5ml 振敲 80 次 混 匀 作用 10min 取适宜稀释度悬 液 1 0ml 接种平 板 2 个 样本 活菌培养计 数 活菌培养计 数 用中和剂 10 倍系列稀释 用中和产物 10 倍系列稀 释 用稀释液 10 倍系列稀释 PBS 中和剂 各 1 0ml 接 种平板 第 1 组不长第 2 组菌数第 3 4 5 组菌数相似 第 6 组无菌 中和剂鉴定评 价规定 菌或明显少 于第 2 组 大于 5 且明 显少于第 3 4 5 组 误差率 15 生长 三组间平均菌数 第 3 4 5 组菌数 3 误差 率 三组平均菌数 各组菌落平均数 中和剂鉴定合 格标准中对 1 2 组菌数要求 0 5 X 1 10 X 5 Y 10 1 5 Y 的绝对值之和 3 三组间平均菌数 100 符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用 中和剂与试验样品的中 结论 和产物对指示菌无毒害 鉴定为该试验样品的中和剂 a 菌悬液浓度及制备 用 PBS 将指示菌制成1 10 4 9 104 cfu ml 悬液 GB15979 备注 b 中和产物的配置 先将试验样液1 0ml 与中和剂溶液 9ml 混合 作用 10min 后制成 七 消毒剂的常用中和剂的配置 1 用于氯型杀菌剂 有效氯0 1 0 5 硫代硫酸钠 2 用于非氧化型杀菌剂 a 磷酸二氢钾 1 36g 磷酸氢二钠 2 83g 卵磷脂 10 0g 甘氨酸 10 0g 吐温 80 30 0g 蒸馏水 1000ml b 磷酸二氢钾 1 36g 磷酸氢二钠 2 8