大肠杆菌的培养

大肠杆菌种子液的制备大肠杆菌种子液的制备 牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方 液体培养基液体培养基 牛肉膏 3 0g 蛋白胨 10 0g 氯化钠 5 0g 水 1000ml pH 7 4 7 6 固体培养基在液体培养基的基础上再加入固体培养基在液体培养基的基础上再加入 1 5 2 0 的琼脂 的琼脂 1 试管斜面与平板的制备试管斜面与平板的制备 1 称量 按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 琼脂 水 放入烧杯中 2 熔化 在上述烧杯中先加入少于所需要量的水 用玻璃棒搅匀 然后 在石 棉网上加热使其溶解 药品完全溶解后 补充水到所需的总体积 将称量好 的 1 8 琼脂放入已溶的药品中 再加热熔化 最后补充所损失的水分 3 调 PH 在未调 PH 前 先用精密 PH 试纸测量培养基的原始 PH 如果偏酸 用滴管向培养基中逐滴加入 1mol L NaOH 边加边搅拌 并随时用 PH 试纸测 基 PH 直到 PH 达到 7 4 7 6 反之用 1mol L HCl 进行调节 4 分装 将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中 其试管装量不超过管高的 1 5 三角烧瓶的量不超过 1 2 加塞 培养基分装完毕后 在试管口和三角烧 瓶口上塞上棉塞 5 包扎 加塞后 将全部试管用麻绳捆好 再在棉塞外包一层牛皮纸 其外再 用一道麻绳扎好 用记号笔注明培养基名称 配制日期 6 灭菌 将上述培养基以 0 1Mpa 121 15min 高压蒸气灭菌 7 倒平板 取三个已消毒的培养皿 在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基 倒制三个平板培养基 冷却 8 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷却至 50 左右 将试管口端搁在玻璃棒上 搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜 2 接种大肠杆菌斜面种子接种大肠杆菌斜面种子 1 取实验室储备的大肠杆菌 BL21 种子 在酒精灯附近 用接种环在已制备 好的斜面上接种上大肠杆菌 2 将接种好的斜面放入 37 的恒温培养箱子中培养 24h 3 制备平板种子制备平板种子 1 在无菌条件下 取一支保存的大肠杆菌的斜面 用无菌生理盐水将菌种冲洗 下来 再用无菌生理盐水将其梯度稀释为 1 倍 10 倍 100 倍和 1000 倍 用 移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板 每个梯度涂布三个平板 每次吸取溶 液 100ul 然后在 37 培养箱中过夜 12 次日 挑取生长状态好 特征明显的单个菌落 接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白 胨液体培养基中 37 170r min 恒温振荡培养 18h 作种子培养液 其后的实验中 其后的实验中 每次实验前从种子培养液中吸取每次实验前从种子培养液中吸取 2ml 菌液菌液接种于新鲜灭菌的液体培养基中 接种于新鲜灭菌的液体培养基中 37 170r min 恒温振荡培养恒温振荡培养 使用牛肉膏蛋白胨培养基 组成成分 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g Nacl 5g 琼脂 15 20g 水 1000mL PH7 4 7 6 具体配置步骤 1 称药品 按实际用量计算后 按配方称取各种药品放入大烧杯中 牛肉膏可放在小烧杯或表 面皿中称量 用热水溶解后倒入大烧杯 也可放在称量纸上称量 随后放入热水中 牛肉膏使与 称量纸分离 立即取出纸片 蛋白胨极易吸潮 故称量时要迅速 2 加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量 然后放在石棉网上 小火加热 并用玻棒搅拌 待 药品完全溶解后再补充水分至所需量 若配制固体培养基 则将称好的琼脂放入己溶解的药品 中 再加热融化 此过程中 需不断搅拌 以防琼脂糊底或溢出 最后补足所失的水分 3 调 pH 检测培养基的 pH 若 pH 偏酸 可滴加 lmol L NaOH 边加边搅拌 并随时用 pH 试纸 检测 直至达到所需 pH 范围 若偏碱 则用 lmol L HCl 进行调节 pH 的调节通常放在加琼脂之 前 应注意 pH 值不要调过头 以免回调而影响培养基内各离子的浓度 4 过滤 液体培养基可用滤纸过滤 固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤 以利培养的观察 但是 供一般使用的培养基 这步可省略 5 分装 按实验要求 可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内 分装时可用漏斗以免使培养 基沾在管口或瓶口上而造成污染 分装量 固体培养基约为试管高度的 l 5 灭菌后制成斜面 分装入三角瓶内以不超过其容积的 一半为宜 半固体培养基以试管高度的 1 3 为宜 灭菌后垂直待凝 6 加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花 非脱脂棉 制作的棉塞 棉塞的形状 大小和松紧 度要合适 四周紧贴管壁 不留缝隙 才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用 要使棉塞总长 约 3 5 塞入试管口或瓶口内 以防棉塞脱落 有些微生物需要更好的通气 则可用 8 层纱布制成 通气塞 有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞 7 包扎 加塞后 将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸 以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞 若 培养基分装于试管中 则应以 5 支或 7 支在一起 再于棉塞外包一层牛皮纸 用绳扎好 然后用 记号笔注明 培养基名称 组别 日期 8 灭菌 将上述培养基于 121 3 湿热灭菌 20min 如因特殊情况不能及时灭菌 则应故入冰箱 内暂存 9 无菌检查 将灭菌的培养基放入 37 温箱中培养 24 48h 无菌生长即可使用 或贮存于冰 箱或清洁的橱内 备用 大肠杆菌的培养 37 摄氏度 恒温培养 48 到 72 小时 因为接种时和具体培养条件的不同 其生长一般都在 2 天外才能长出明显的菌落 菌落特征 乳白色 圆形 菌落边缘整齐 表面光滑 表面和背面颜色一致 大肠杆菌 大肠菌群显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基 用于食品 水 牛奶 冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测 大肠杆菌显蓝色至紫色 大肠菌群显 红色 成份 g L 特殊营养物质 28 19 混合显色剂 0 31 琼脂 13 0 pH 6 8 0 2 25 此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果 注意 此培养基仅供实验室使用 用法 称取本品 41 5g 加入 1000ml 蒸馏水 加热溶解并不停搅拌 煮沸不要超过 1 分钟 取 1ml 制备好的样品液加入直径为 9cm 无菌平皿中心 倾入冷却至 45 50 培养基约 15ml 混匀 凝固后 再加入一层培养基进行履盖 或冷却至 45 50 时 倾入无菌平皿 琼 脂完全凝固后 在 37 的培养箱中倒置放置 1 2 小时 加入适当稀释度的样品液 1ml 涂布于培养基上 36 1 培养 18 24h 贮存 制备好的平板应立即使用 应避免光线直接照射 干燥培养基应放置于阴暗干燥处 保存 温度 2 8 注意避光保存 失效 干燥培养基超过保质期 结块和颜色变化都不能使用 操作步骤 1 按国家标准 SN 标准 FDA 标准或其它方法制备样品液 2 取样品液 1ml 加入 冷却至 45 50 显色培养基中混匀或 涂布于平板上 3 36 1 培养 18 24h 选用有 30 200 个菌落的平板 计数平板上出现的 典型大肠菌群和大肠杆菌菌落 大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色 大肠菌群为粉红色菌落 其它细菌为无色或黄色菌落 总大肠菌群 蓝色菌落 紫色菌落 粉红色菌落 大肠杆菌 蓝色菌落 紫色菌落 4 对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上 36 1 培养 12 16 小时 挑 取单菌落做大肠杆菌全套生化试验 本公司有生化鉴定管套装 20 支 x3 种 质量控制 1 外观 此干燥培养基的粉末均匀 具有良好的流动性 呈淡红色 制备好的平板呈透明粉红色固 体培养基 2 微生物试验 在 36 1 培养 18 24h 小时 质控菌株 ATCC 生长情况 菌