上海交大网络课程检验微生物讲义4

第十三章 弯曲菌属和螺杆菌属 一 教学大纲要求 1 弯曲菌属的主要特点及分类 临床意义 细菌特性 实验室检查 2 螺杆菌属的主要特性 分类 3 幽门螺杆菌的临床意义 细菌特性 实验室检查 二 教材内容精要 一 弯曲菌属 1 弯曲菌属的主要特点及分类 弯曲菌属 Campylobacter 是一类呈逗点状或 S 形的革兰阴性杆菌 广泛分布于动物界 其中有些可 引起动物和人类的腹泻 胃肠炎和肠道外感染 目前弯曲菌属共有 18 个菌种和亚种 引起人类疾病的主要是空肠弯曲菌空肠亚种 其次是胎儿弯曲 菌和大肠弯曲菌等 2 细菌特性 1 形态染色 本属细菌为革兰阴性无芽孢的弯曲短杆菌 不易染色 菌体弯曲呈 S 状或海鸥展翅 状等 一端或两端各有一根鞭毛 运动活泼 暗视野显微镜下呈 投标样 运动 2 培养特性 微需氧菌 最适生长环境是含氧气 5 二氧化碳 10 氮气 85 孵育温度通常 取决于所需要分离的菌株 在不同的温度下培养基的选择性也不同 通常绝大多数实验室用 42 作为初 始分离温度 这一温度对空肠弯曲菌 大肠弯曲菌的生长有利 相反其他菌株在 37 生长良好 营养要求高 在普通培养基上不生长 分离弯曲菌常用的选择性培养基大多含有抗生素 主要为头 孢哌酮 以抑制肠道正常菌群 常用的有含血的 Skirrow 培养基 头孢哌酮 万古霉素 两性霉素琼脂培养 基 CVA 和不含血的碳 头孢哌酮 去氧胆酸盐 CCDA 碳基选择性培养基 CSM 和半固体动力培 养基等 3 生化反应 氧化酶和触酶阳性 可还原硝酸盐为亚硝酸盐 不分解和不发酵各种糖类 不分解 尿素 具体生化反应见表 13 1 4 抵抗力 本属细菌的抵抗力弱 对一般消毒剂敏感 但耐寒 在 4 冰箱或水中可存活达 4 周 表 13 1 弯曲菌属的生化特征 生化试验 空 肠 弯 曲 空 肠 弯 曲 大 肠 弯 曲 胎 儿 弯 曲 胎 儿 弯 曲 海 鸥 弯 曲 乌 普 萨 拉 豕 肠 炎 弯 唾 液 弯 曲 唾 液 弯 曲 唾 液 弯 曲 瑞 士 弯 曲 粘 膜 弯 曲 简 明 弯 曲 屈 曲 弯 曲 粪 弯 曲 菌 昭 和 弯 曲 菌 空 肠 亚 种 菌 多 氏 亚 种 菌菌 胎 儿 亚 种 菌 性 病 亚 种 菌弯 曲 菌 曲 菌 菌 唾 液 生 物 型 菌 牛 生 物 型 菌 粪 生 物 型 菌菌菌菌菌 氧化酶 V W 硝酸盐还原 亚硝酸盐还原 ND ND 需 H2 V 脲酶 V H2S 马尿酸盐水解 V 醋酸吲哚酚水解 15 生长 25 生长 42 生长 W 3 5 NaCl 生长 V 1 甘油 V V V 麦康凯培养基 ND NDNDND 萘啶酸VSSVRRSRSRRSRRSSR 头孢噻吩RSRSSRSSSSSSSRNDNDS 注 90 阳性 10 阳性 V 可变 ND 未定 W 反应较弱 S 敏感 R 耐药 3 临床意义 弯曲菌的传播途径主要为食物和水 传播方式多为经口传播 食用未煮熟的鸡 饮用未经处理的水 和未经消毒的牛奶均可引起弯曲菌肠炎的发生 本菌具有黏附定居和入侵上皮细胞的能力 通过产生的 肠毒素 细胞毒素和内毒素等多种毒力因子致病 病变部位通常在空肠 回肠 也可蔓延至结肠 空肠弯曲菌空肠亚种是弯曲菌中最重要也是最常见的的人体致病菌 占弯曲菌腹泻的 80 90 腹泻是空肠弯曲菌感染最常见的临床表现 除肠炎外 近年来也出现了空肠弯曲菌继发关节炎败血症 脑膜炎和格林巴利综合征 GBS 病人分离到的空肠弯曲菌大都具有特殊的血清型 O 19 可与人体的神经 组织发生交叉免疫反应而致病 胎儿弯曲菌主要引起肠道外感染 其中胎儿亚种和猫 绵羊的感染性流产关系密切 较少引起人类 感染 感染人体常引起全身症状 4 微生物学检验 1 检验程序 见图 13 1 粪便 肛拭 剩余食物 血液 脑脊液 直接检查 卡 布运送培养基 布氏肉汤增菌 分离培养 动力检查 直接镜检 弯曲菌选择性培养基 7 天后不生长弃去 微需氧环境 25 37 42 48 72h 可疑菌落 粉红 光滑 半透明 动力观察 涂片 革兰染色 投标样运动 革兰阴性 弯曲菌 氧化酶 生化反应鉴定 报告 图 13 1 弯曲菌属的检验程序 2 标本采集 可采集粪便 肛拭子及剩余食物 标本采集后应立即送检 或将标本接种于卡 布 运送培养基中送检 对于高烧和患脑膜炎的病人 可于用药前抽取静脉血或脑脊液 注入布氏肉汤中送 检 3 检验方法 1 显微镜检查 悬滴法动力检查 显微镜下观察有无螺旋状或投标样运动 脑脊液标本经离心沉 淀后再制成悬滴标本检查 染色标本检查 取新鲜粪便或脑脊液离心沉淀物涂片 革兰染色 查找革 兰阴性 弯曲呈 S 状或螺旋状杆菌 鞭毛染色见一端或两端单根鞭毛 2 分离培养 可将标本直接接种于选择性培养基上 也可将标本过滤后培养 弯曲菌形成的菌落为 灰色 扁平 表面湿润 圆形凸起 边缘不规则 常沿穿刺线蔓延生长的菌落 在血平板上不溶血 本 属细菌在布氏肉汤中呈均匀混浊生长 培养时需注意气体环境和适合的温度 空肠弯曲菌最适的温度为 42 43 胎儿弯曲菌在 42 不生长 3 鉴定 弯曲菌属的鉴定比较复杂 必须综合多种试验才能确定 通常在弯曲菌选择培养基上氧化 酶阳性 革兰染色阴性 弯曲呈 S 形或螺旋形的细菌初步鉴定为弯曲菌 进一步的鉴定试验有 马尿 酸盐水解试验 本试验是鉴别空肠弯曲菌空肠亚种和多氏亚种的重要试验 在弯曲菌选择性培养基上经 42 孵育 氧化酶阳性 有特征性的弯曲菌形态 辅以马尿酸盐试验阳性即可报告为空肠弯曲菌空肠亚 种 醋酸吲哚水解试验 本试验空肠弯曲菌为阳性而胎儿弯曲菌为阴性 萘啶酸 头孢噻吩耐药试 验 空肠弯曲菌和大肠弯曲菌对萘啶酸敏感 对头孢噻吩耐药 胎儿弯曲菌对萘啶酸耐药而对头孢噻吩 敏感 近来出现了对萘啶酸耐药的空肠弯曲菌和大肠弯曲菌 应结合马尿酸盐水解试验进行鉴定 弯曲菌的其余鉴定试验有 不同温度的生长试验 25 37 42 触酶试验 硝酸盐还原试验 产 H2S 试验等 见表 13 1 4 耐药性 由于弯曲菌感染大多呈轻症和自限性 一般不需特异性治疗 体外试验显示 绝大多 数弯曲菌对头孢菌素和青霉素耐药 环丙沙星治疗弯曲菌感染非常有效 但近年来也出现了不少耐药菌 株 空肠弯曲菌通常对红霉素敏感 其耐药率小于 5 而 80 以上的大肠弯曲菌对红霉素耐药 胎儿 弯曲菌引起的全身感染可用红霉素 氨苄西林 氨基糖苷类和氯霉素治疗 二 幽门螺杆菌 1 螺杆菌属的主要特点及分类 螺杆菌属 Hilicobacter 是一群氧化酶和触酶阳性 微需氧 37 能够生长 在 25 和 42 均生长 不良的革兰阴性弯曲菌 本属细菌最早根据形态染色 培养条件等归于弯曲菌属 1989 年 Goodwin 根据 其超微结构 酶活性 脂肪酸序列 生长特性等的不同 建议将其从弯曲菌属中划分出来而成立一个新 的属 Hilicobacter 螺杆菌属 本属中现已鉴定的有 19 个种 研究得最多 最常见的是幽门螺杆菌 H pylori Hp 2 幽门螺杆菌的细菌特性 1 形态染色 HP 为革兰阴性 无芽孢 呈螺旋状弯曲的杆菌 尤其在胃黏膜环境中 HP 具有典 型的螺旋形或弯曲形形态 但在陈旧培养物中菌体可呈圆球状 大多数细菌具有位于菌体一端的多根带 鞘鞭毛 运动活泼 2 培养特性 HP 为微需氧菌 在需氧及厌氧环境下均不能生长 在潮湿环境 37 同时提供 5 10 O2 5 12 CO2的条件下生长良好 5 10 H2可刺激其生长 最适生长温度 35 37 30 和 42 均生长不良 此点可与其他弯曲菌相区别 pH5 5 8 5 均能生长 营养要求高 普通培养基不能生长 常用的培养基有心脑浸出液琼脂 布氏琼脂 哥伦比亚琼脂等 培养基中需补充 一些特殊物质如血液 血清 淀粉 活性炭等 在 Campy BAP 培养基上不生长 选择培养基可用改良的 Skirrow 琼脂培养基加入万古霉素 两性霉素和 cefsulodin 本菌在非选择性血平板上经 3 5 天孵育后形 成小的半透明灰色菌落 有微弱的溶血环 革兰染色很浅 3 生化反应 生化反应不活泼 氧化酶和触酶阳性 不分解任何糖类 脲酶强阳性 可与本属其 他细菌区别 也是检测 HP 的快速诊断方法之一 具体生化特征见表 13 2 表 13 2 螺杆菌属各菌种的生化特征 菌种触酶 硝酸盐 还原 碱性磷 酸酶 脲酶 醋酸吲哚 酚水解 谷氨酸 转肽酶 42 生长 1 甘油 萘啶 酸 头孢 噻吩 幽门螺杆菌 RS 毕氏螺杆菌 RS 犬螺杆菌 ND NDSI 同性恋螺杆菌 SI 菲氏螺杆菌 SS 幼禽螺杆菌 ND NDRS H westmeadii NDND NDSR 注 90 阳性 10 阳性 ND 未定 S 敏感 R 耐药 I 中介 4 抵抗力 HP 对酸敏感 尿素对 HP 可起到保护作用 1 胆盐可抑制 HP 生长 2 临床意义 HP 有较强的鞭毛动力和对胃黏膜 黏液有较强的黏附力 使 HP 能在接近中性的黏膜层中定植 产生 强活性的尿素酶 分解尿素 在菌体周围形成保护性氨环境 以抵抗胃黏膜上皮细胞分泌的胃酸 HP 产 生的蛋白酶能有效分解黏液蛋白 提供营养 HP 在胃内定植后 通过对胃黏膜上皮细胞的黏附性 胃肠激素的作用 细胞壁脂多糖中脂质 A 的致 炎作用 产生多种酶 包括 尿素酶 蛋白酶 过氧化氢酶 脂酶和磷脂酶等 以及产生的细胞毒素等 等 这些因素的共同作用导致临床疾病的发生 在临床上主要引起消化性溃疡 十二指肠溃疡 胃溃疡 慢性活动性胃窦炎等 长期感染易发展为萎缩性胃炎 胃腺癌和胃黏膜淋巴组织淋巴瘤 3 微生物学检验 1 检验程序 见图 13 2 胃 十二指肠活检标本 血清 胃液 显微镜检查 PCR 分离培养 血清检测 快速尿素 微需氧 高湿度 革兰 病理 免疫 酶试验 30 37 42 IgG SIgA 染色 切片 组化 3 7d 特殊 染色 初报 30 不长 37 生长 42 不长 可疑菌落 革兰染色 氧化酶 触酶 动力 生化反应 报告 图 13 2 幽门螺杆菌检验程序 2 标本采集 多部位采集胃 十二指肠黏膜标本 标本要新鲜 保持湿润 置 2ml 无菌等渗盐水 中保存 在运送途中不超过 3h 在 4 下最多保存 5h 流行病学调查和检测治疗效果时可取血清检查 3 检验方法 1 显微镜检查 直接镜检 取胃 十二指肠黏膜活检标本作革兰染色 在油镜下查找细长弯曲或 呈海鸥展翅状排列的菌体 由于涂片是在 HP 定植部位的黏膜进行观察 阳性率很高 是简便 实用 准 确和较快速的诊断方法 组织学切片 可行 Warthin Starry 银染色 改良 Giemsa 染色 甲苯胺蓝染色 石炭酸复红染色等 2 分离培养 用含 5 绵羊血的布氏琼脂或加入 7 马血的心脑浸液作为非选择性培养基 用改良 的 Skirrow 琼脂 加入万古霉素 10mg L 两性霉素 B10mg L 甲氧苄啶 5mg L 作为选择性培养基 在 含 5 O2 10 CO2 85 N2的微需氧环境中 37 孵育 3 5 天 长出细小 灰白色 半透明 不溶血的 菌落 3 快速检查 快速脲酶试验 取一小块新鲜活检标本置于含尿素的培养基中 由于幽门螺杆菌产 生大量的细胞外尿素酶 相当于普通变形杆菌的 20 70 倍 可分解尿素产大量的氨 使培养基 pH 升高 指示剂变色 能在 5min 30min 内检测出幽门螺杆菌 这是一种简便实用 快速灵敏且较为准确的检测 Hp 方法 适合胃镜检查的病人 核素标记试验 本试验的敏感性和特异性均很高 但操作起来稍繁琐 PCR 是一种高度敏感和特异的方法 但由于实验条件要求较高 目前仅用于实验研究 抗原检测 可用已有的商品化试剂盒 用 ELISA 法直接检测