引物设计的几点重要原则

PCR 引物设计的 11 条黄金法则 1 引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的 在 NCBI 上搜索不同物种的同一 基因 通过序列分析软件 比如 DNAman 比对 Alignment 各基因相同的序列就是该 基因的保守区 2 引物长度一般在 15 30 碱基之间 引物长度 primerlength 常用的是 18 27bp 但不应大于 38 因为过长会导致其延伸温度 大于 74 不适于 TaqDNA 聚合酶进行反应 3 引物 GC 含量在 40 60 之间 Tm 值最好接近 72 GC 含量 composition 过高或过低都不利于引发反应 上下游引物的 GC 含量不能相差太 大 另外 上下游引物的 Tm 值 meltingtemperature 是寡核苷酸的解链温度 即在一定 盐浓度条件下 50 寡核苷酸双链解链的温度 有效启动温度 一般高于 Tm 值 5 10 若按公式 Tm 4 G C 2 A T 估计引物的 Tm 值 则有效引物的 Tm 为 55 80 其 Tm 值最好接近 72 以使复性条件最佳 4 引物 3 端要避开密码子的第 3 位 如扩增编码区域 引物 3 端不要终止于密码子的第 3 位 因密码子的第 3 位易发生简并 会影响扩增的特异性与效率 5 引物 3 端不能选择 A 最好选择 T 引物 3 端错配时 不同碱基引发效率存在着很大的差异 当末位的碱基为 A 时 即使在错 配的情况下 也能有引发链的合成 而当末位链为 T 时 错配的引发效率大大降低 G C 错配的引发效率介于 A T 之间 所以 3 端最好选择 T 6 碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高 尤其是 3 端相似性较高的序列 否则容易导致错 误引发 Falsepriming 降低引物与模板相似性的一种方法是 引物中四种碱基的分布最 好是随机的 不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在 尤其 3 端不应超过 3 个连续的 G 或 C 因这 样会使引物在 GC 富集序列区错误引发 7 引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物自身不应存在互补序列 否则引物自身会折叠成发夹结构 Hairpin 使引物本身复性 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合 引物自身不能有连续 4 个碱基 的互补 两引物之间也不应具有互补性 尤其应避免 3 端的互补重叠以防止引物二聚体 Dimer 与 Crossdimer 的形成 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话 应尽量使其 G 值不要过高 应小于 4 5kcal mol 否则易导致产生引物二聚体带 并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正 常进行 8 引物 5 端和中间 G 值应该相对较高 而 3 端 G 值较低 G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能 它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性 G 值越大 则双链越稳定 应当选用 5 端和中间 G 值相对较高 而 3 端 G 值较低 绝对值 不超过 9 的引物 引物 3 端的 G 值过高 容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚 合反应 不同位置的 G 值可以用 Oligo6 软件进行分析 9 引物的 5 端可以修饰 而 3 端不可修饰 引物的 5 端决定着 PCR 产物的长度 它对扩增特异性影响不大 因此 可以被修饰而不影 响扩增的特异性 引物 5 端修饰包括 加酶切位点 标记生物素 荧光 地高辛 Eu3 等 引入蛋白质结合 DNA 序列 引入点突变 插入突变 缺失突变序列 引入启动子序列等 引物的延伸是从 3 端开始的 不能进行任何修饰 3 端也不能有形成任何二级结构可能 10 扩增产物的单链不能形成二级结构 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响 选择扩增片段时最好避开二级 结构区域 用有关软件 比如 RNAstructure 可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构 有助 于选择模板 实验表明 待扩区域自由能 G 小于 58 6lkJ mol 时 扩增往往不能成功 若不能避开这一区域时 用 7 deaza 2 脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的 11 引物应具有特异性 引物设计完成以后 应对其进行 BLAST 检测 如果与其它基因不具有互补性 就可以进行 下一步的实验了 附 值得一提的是 各种模板的引物设计难度不一 有的模板本身条件比较困难 例如 GC 含 量偏高或偏低 导致找不到各种指标都十分合适的引物 用作克隆目的的 PCR 因为产物 序列相对固定 引物设计的选择自由度较低 在这种情况只能退而求其次 尽量去满足条 件 做 RealTime 时 用于 SYBRGreenI 法时的一对引物与一般 PCR 的引物 在引物设计上所要求的 参数是不同的 引物设计的要求 1 避免重复碱基 尤其是 G 2 Tm 58 60 度 3 GC 30 80 4 3 端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C 5 正向引物与探针离得越近越好 但不能重叠 6 PCR 扩增产物长度 引物的产物大小不要太大 一般在 80 250bp 之间都可 80 150bp 最为合适 可以延长至 300bp 7 引物的退火温度要高 一般要在 60 度以上 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组 DNA 污染影响的能力 即引物应该跨外显 子 最好是引物能跨外显子的接头区 这样可以更有效的不受基因组 DNA 污染的影响 至于设计软件 PRIMER3 PRIMER5 PRIMEREXPRESS 都应该可以的 做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作 对于引物 你要有从一大 堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备 寻找合适的引物非常不容易 关于 BLAST 的作用应该是通过比对 发现你所设计的这个引物 在已经发现并在 GENEBANK 中公开的不物种基因序列当中 除了和你的目标基因之外 还有没有和其他物 种或其他序列当中存在相同的序列 如和你的目标序列之外的序列相同的序列 则可能扩 出其他序列的产物 那么这个引物的特异性就很差 从而不能用 1 简介 寡聚核苷酸引物的选择 通常是整个扩增反应成功的关键 所选的引物序列将决定 PCR 产 物的大小 位置 以及扩增区域的 Tm 值这个和扩增物产量有关的重要物理参数 好的引 物设计可以避免背景和非特异产物的产生 甚至在 RNA PCR 中也能识别 cDNA 或基因组模 板 引物设计也极大的影响扩增产量 若使用设计粗糙的引物 产物将很少甚至没有 而 使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值 当然 即使有了好 的引物 依然需要进行反应条件的优化 比如调整 Mg2 浓度 使用特殊的共溶剂如二甲 基亚砜 甲酰胺和甘油 计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效 一些影响 PCR 反应中引物作用的因素 诸如溶解温度 引物间可能的同源性等 易于在计算机软件中被编码和限定 计算机的高 速度可完成对引物位置 长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量 计算 通过对成千种组合的检测 调整各项参数 可提出适合用户特殊实验的引物 因此 通过计算机软件选择的引物的总体 质量 由用户在程序参数中设定 保证优于通过人工 导出的引物 需要指出的是 引物不必与模板完全同源 因此可包含启动子序列 限制酶识别位点或 5 端的各种修饰 这种对引物的修饰不会妨碍 PCR 反应 而会在以后使用扩增子时发挥作用 2 基本 PCR 引物设计参数 引物设计的目的是在两个目标间取得平衡 扩增特异性和扩增效率 特异性是指发生错误 引发的频率 特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的 PCR 扩增子 在 EB 染 色的琼脂糖凝胶上可见到 引物效率是指在每一 PCR 循环中一对引物扩增的产物与理论上 成倍增长量的接近程度 引物长度 特异性一般通过引物长度和退火温度控制 如果 PCR 的退火温度设置在近于引物 Tm 值 引物 模板双链体的解链温度 几度的范围内 18 到 24 个碱基的寡核苷酸链是有很好的 序列特异性的 引物越长 扩增退火时被引发的模板越少 为优化 PCR 反应 使用确保溶 解温度不低于 54 的最短的引物 可获得最好的效率和特异性 总的来说 最好在特异性允许的范围内寻求安全性 每增加一个核苷酸 引物特异性提高 4 倍 这样 大多数应用的最短引物长度为 18 个核苷酸 引物设计时使合成的寡核苷酸链 18 24 聚物 适用于多种实验条件仍不失为明智之举 引物的二级结构 包括引物自身二聚体 发卡结构 引物间二聚体等 这些因素会影响引物和模板的结合从 而影响引物效率 对于引物的 3 末端形成的二聚体 应控制其 G 大于 5 0kcal mol 或少于 三个连续的碱基互补 因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性 引 物中间或 5 端的要求可适当放宽 引物自身形成的发卡结构 也以 3 端或近 3 端对引物 模 板结合影响更大 影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外 与茎环结 构形式亦有很大的关系 应尽量避免 3 末端有发卡结构的引物 引物 GC 含量和 Tm 值 PCR 引物应该保持合理的 GC 含量 含有 50 的 G C 的 20 个碱基的寡核苷酸链的 Tm 值大 概在 56 62 范围内 这可为有效退火提供足够热度 一对引物的 GC 含量和 Tm 值应该 协调 协调性差的引物对的效率和特异性都较差 因为降低了 Tm 值导致特异性的丧失 这种情况下引物 Tm 值越高 其错误引发的机率也越大 若采用太高的退火温度 Tm 值低 的引物对可能完全不发挥作用 在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一 对新的引物时 这种 GC 含量和 Tm 值的协调非常关键 一般来说 一对引物的 Tm 值相差 尽量不超过 2 3 摄氏度 同时引物和产物的 Tm 值也不要相差太大 20 摄氏度范围内较 好 引物的额外序列与退火温度 若有额外的序列信息要加到引物中 例如 T7RNA 聚合酶结合位点 限制酶切位点或者 GC 发夹结构可以使用加长的引物 一般说来 引物 5 端添加无关序列不会影响引物特异序列 的退火 有时候 引物中添加了大量与模板不配对的碱基 可以在较低退火温度的条件下 进行 4 到 5 个扩增循环 然后在假定引物 5 端序列已经加入到模板中 计算得出的退火温 度下进行其余的循环 在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别 序列的 5 端有 2 至 3 个非特异的额外碱基 这样就会增加引物的非模板特异序列的长度 长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算 而这对于确定 PCR 反应时的退火温 度又是必须的 对于低于 20 个碱基的引物 Tm 值可以根据 Tm 4 G C 2 A T 计算 而对 于较长的引物 Tm 值需要考虑动力学参数 从 最近邻位 的计算方式得到 现有的 PCR 引 物设计软件大多数都采用这种方式 引物的 3 末端核苷酸组成 引物 3 末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的 而引物 3 末端最后 5 到 6 个核苷酸的错配应尽可能的少 如果 3 末端的错配过多 通过降低反应的退火温度来 补偿这种错配不会有什么效果 反应几乎注定要失败 引物 3 末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性 应特别注意引物不能互补 尤其是 在 3 末端 引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现 这样获得的 PCR 产物其实是 引物自身的扩增 这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争 PCR 状态 从而影响 扩增成功 引物 3 末端的稳定性由引物 3 末端的碱基组成决定 一般考虑末端 5 个碱基的 G 此值的 大小对扩增有较大的影响 负值大 则 3 末端稳定性高 扩增效率更高 同时也更易于异 位引发 需要注意的是 引物 3 末端应尽量避免 T 实验证明 以 T 结尾的引物即使与 T G 或 C 错 配仍可有效延伸 PCR 产物的长度及在耙序列内的位置 所有的计算机程序都提供对 PCR 产物长度范围的选择 一般说来 PCR 产物长度对扩增效 率有影响 特定的应用情况下 PCR 产物长度部分取决于模板材料 预期产物的特定长度经常取决于应用的需要 若目的是建立测定特异 DNA 片段的临床检验 方法 120 300bp 的小 DNA 扩增产物可能是最好的 产物应具有好的特异性和高的产生 效率 并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息 这一长度范围的产物可以通过采用两 步扩增循环方法得到 从而减少扩增时间 其他 PCR 方法有不同的最佳产物长度 例如 通过定量的 RNA PCR 检测基因表达时 产物 应该足够大以便构成竞争性模板 这样 产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来 这些产物一般在 250 750bp 范围内 补充说明 若在 cDNA 序列内找寻 PCR 引物 需特别注意两点 首先 尽力将引物和产物保持在 mRNA 的编码区域内 因为这是生成蛋白质的独特序列 不像 3 末端非编码区域与许多其 他 mRNA 有同源性 第二 尽力把引物放在不同的外显子上 以便使 RNA 特异的 PCR 产物 与从污染 DNA 中产生的产物在大小上相区别 若 PCR 的目的是克隆一个基因或 cDNA 的特异序列 产物的大小是根据具体应用预选的 在这里 计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息 在选择用来扩增来自不同物种 DNA 的引物时 应避开 mRNA 的 5 和 3 末端非翻译区序列 因为它们可能没有任何的同源性 3 简并引物设计 设计简并引物时 一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度 很显然 我们 期望选择简并度最低的氨基酸 达到提高特异性的目的 充分注意物种对于密码子的偏好性 选择该物种使用频率高的密码子