中药药理研究思路与方法

1,中药药理学研究思路与方法,张艳军2010年1月,2,主要内容,一、中药药理学的概念二、中药药理学学科任务三、中药药理的发展趋势四、中药药理研究模式五、中药毒理研究发展趋势六、总 结,3,中药药理学是以中医药基本理论为指导,运用现代科学方法,研究中药和机体相互作用规律的一门学科。,一、中药药理学的概念,中药药效学中药毒理学,中药药动学,中药药理学,4,二、中药药理学学科任务,指导临床合理用药，提高疗效,阐明中医药理论的现代科学本质,为中药配伍和新药研究提供现代科学依据,探讨中药防治疾病的现代科学依据,5,三、中药药理的发展趋势,中药单体的作用机理的深入研究中药复方的药理及物质基础及配伍规律研究中药药性理论研究中药毒理研究中药代谢动力学研究,6,四、中药药理学研究模式,1.中药单体的研究,7,Berberine is a novel cholesterol-lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins,Weijia Kong,Jing Wei,Parveen Abidi,et al.Nature Medicine,2004,10(12):1344,例-1,8,Figure-1 Upregulation of LDLR expression by BBR in human hepatoma cell lines,9,Figure-2 BBR increases LDLR expression by stabilizing LDLR mRNA through the 5 proximal section of the LDLR mRNA 3UTR.,10,Figure-3(a) The activity of BBR on LDLR expression was most sensitive to U0126.,Figure-3 Blocking ERK activation abolished the regulatory effect of BBR on LDLR.,Figure-3(b) BBR rapidly activated ERK and the kinetics of ERK activation preceded the upregulation of LDLR expression by BBR.,Figure-3(c) The activation of ERK by BBR is also dose dependent.,11,Figure-4 BBR reduces plasma LDL-c and increases liver LDLR expression in hamsters.,Figure-4(a),Figure-4(b),Figure-4(a):Treatment of hyperlipidemic animals with BBR resulted in dose-dependent decreases in both serum total cholesterol and LDL-c.,Figure-4(b):3.5-fold increase in mRNA and a 2.6-fold increase in protein hamster livers treated with 100mg/kg/d of BBR.,12,Figure-5 BBR lowered serum LDL-c in hypercholesterolemic people,Figure-6 BBR treatment also significantly improved liver function in this subgroup,13,Results & conclusion:,Oral administration of BBR in 32 hypercholesterilemic patients for 3 months reduced serum cholesterol by 29%,triglycerides by 35% and LDL-cholesterol by 25%.Treatment of hyperlipidemic hamsters with BBR reduced serum cholesterol by 40% and LDL-cholesterol by 42%,with a 3.5-fold increase in hepatic LDLR mRNA and a 2.6-fold increase in hepatic LDLR protein.Using human hepatoma cells,BBR upregulates LDLR expression independent of sterol regulatory element binding proteins, but dependent on ERK activation.BBR elevates LDLR expression through a post-transcriptional mechanism that stabilizes the mRNA.Using a heterologous system with luciferase as a reporter, the 5 proximal section of the LDLR mRNA 3 untranslated region responsible for the regulatory effect of BBR.BBR as a new hypolipidemic drug with a mechanism of action different from that of statin drugs.,14,2.中药复方药理研究的思路与方法,一个结合二个基本讲清三个化学层次四个药理水平,中药复方药理研究总思路,15,(一)中药复方组分配伍研究(二)基于定向剔除技术的复方药效物质基础研究(三)中药血清药理学研究(四)体外血脑屏障模型研究.,中药复方药理研究方法,16,方剂是一个复杂体系，其作用的人体也是一个复杂系统，面对双重复杂系统，必须在复杂性科学理论的指导下，将复杂系统中非线性规律部分降阶、降维为线性规律去研究。因此，研究必须遵循“复杂-简单-复杂”的原则，借鉴现代药学的研究方法，发挥中医药理论优势，保持中药方剂的配伍特点，创建基于组效关系的组分配伍研制现代中药的理论模式和相关技术体系，研制创新中药。,(一)中药复方组分配伍研究,17,药物研究思路之比较,18,19,19, NAT REV DRUG DISCOV, DDT等认为多成分组合药物将成为未来药物的主流 国际上针对不同靶点，对已上市单分子药物进行组合设计，研发治疗肿瘤等复杂性疾病的新药已经启动 多组分药物设计已成为新兴的药学研究前沿,21世纪是复方药物的世纪,20,现 代 中 药 研 制 模 式,21,张伯礼，等. 中国天然药物，2003，3(5):269272,现代中药的基础和应用基础研究,22,22,心血管药物研究关键技术,23,23,脑血管病药物研究关键技术,24,中药有效组分/成分,关联规则分析,有效组分组合物,实验验证,组效关系数据,配伍配比优化,优化策略,组效关系建模,优化算法,模型校正,Yi Wang et.al, Chem Biol 46:605-611,临床经验文献知识,试验设计计算建模,虚拟组方全局寻优,统计回归,仿真计算,经验设计模式,虚拟设计模式,经验与试验结合,减毒增效,效应配伍,遗传算法,随机搜索,组分配伍优化设计关键技术,25,复方丹参方的现代研究,例-2,组分配伍优化设计现代中药发现新模式,26,丹参水溶性组分,丹参脂溶性组分,三七皂苷类组分,复方丹参方的标准组分,丹参素,丹酚酸B,人参皂苷Rb1,人参皂苷Rg1,三七皂苷R1,丹参酮 A,27,组效关系研究,28,基于组效关系的组分配伍优选,F,D,A,配伍组合,均匀设计,B,E,C,组分分离分析,A:丹酚酸B:丹参素C:丹参酮D:三七总皂苷E:三七黄酮F:冰 片,配伍协同效应,张伯礼，等.复方丹参方药效物质及作用机理研究. 世界科学技术中医药现代化，2003，5(5):1417,29,等比设计-非线性建模-多目标优化,非线性建模：方剂不同配比与药效之间的关系采用神经网络算法进行非线性拟合、建模。多目标优化：采用优化计算方法，寻找能使多个药效指标接近综合最优的配伍配比。,商洪才,张伯礼等. 丹参、三七不同配比的多目标模糊优化研究.北京中医药大学学报.2003,26（4）:28-31王睿,张伯礼等.ED-NM-MO三联法在中药方剂配比多目标优化中的应用.天津中医药.2005,23（6）:13-16,Pareto最优集,多目标优化问题解集,30,新方与药典方抗心肌缺血药理作用比较,冠脉血流量,心肌耗氧量,心外膜心电,31,（min）,32,炎性反应相关基因信号转导通路图,全部基因的总图,免疫应答相关基因信号转导通路图,33,免疫应答,丹酚酸B/三七总皂苷抗心肌梗死的分子机制,细胞因子、信号转导调控,Sal B/PNS配伍,炎性反应,能量代谢,离子通道,细胞周期,细胞凋亡,左室重构,血液凝结,RAS,心 肌 梗 死,34,以复方丹参方为载体，通过组效关系、组分配伍、多目标优化等方法，对其进行了组分配伍规律的研究，探询了方剂的药效物质基础和作用机理，揭示了配伍的内在规律，为现代中药发现提供了理论依据及示范性研究。,35,(二)基于定向剔除技术的复方药效物质基础研究,效应比较评价,效应物质(群)对整方效应的贡献,36,(三)中药血清药理研究,1987年, 日本学者首次提出了“血清药理学”的概念, 就是指在动物经口服给药一段时间后采血分离血清, 用此含药血清进行体外药理实验的一种实验方法,它为科学的阐明中药复方的作用及其机制提供了新的研究方法。这种研究方法不仅可排除由于中药复方粗制剂直接加入体外试验系统对实验造成的干扰, 而且含药血清能较接近地反映药物在体内的状态, 使体外试验能较好地重复在体试验的结果。但作为一种新兴的实验方法, 尚处于探索阶段,有许多问题有待于进一步研究和规范化。,37,原方及各药材分析图谱,全方含药血清分析图谱,B,A,C,追踪入血成分,B,A,C,分析归属成分,成分、组分制备,成分、组分含药血清,活性评价,明确药效物质基础、各效应物质对功效的贡献度,原方,血清药理学研究模式,中药复方,38,六味地黄丸补肾、治疗骨质疏松药效物质基础及体内动态研究,建立了六味地黄丸口服的大鼠含药血清色谱指纹图，并系统认定和表征了六味地黄丸的11个血中移行成分。,例-3,39,大鼠血中马钱苷的药时曲线,大鼠血中5-HMFA 的药时曲线,大鼠血中丹皮酚的药时曲线,大鼠血中DHAP 的药时曲线,40,选用经典“ 肾阴虚”动物模型，选择10 项指标，证明了六味地黄丸血中移行成分:5-羟甲基-2-糠酸、莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷和丹皮酚是六味地黄丸补肾作用的药效物质基础。采用体外成骨细胞培养的方法，证明莫诺苷、獐牙菜苷和马钱苷混合物能明显促进大鼠成骨细胞增殖，且与药物浓度呈剂量依赖性，是六味地黄丸治疗骨质疏松的药效物质基础，推测促进成骨细胞增殖是六味地黄丸治疗骨质疏松的机理之一。研究结果初步阐明了六味地黄丸的配伍意义，为方剂配伍规律及复方药代动力学研究关键技术的形成奠定了基础。,张宁，黑龙江中医药大学博士论文,41,(四)体外血脑屏障模型,中药在治疗中枢神经系统疾病方面有较大优势，是新药开发的重要源泉。一些可以针对中枢神经环节发挥药效的药物，应该研究其血脑屏障(BBB)通透能力如何。用血脑屏障体外模型作为载体在中药中寻找促进药物透过血脑屏障新的思路和途径、寻找促进治疗药物通过血脑屏障的方法，对脑内疾病的治疗有重要意义。,42,例-4,舒脑欣滴丸含药血清神对神经再生作用体外实验研究,1.原代培养大鼠神经干细胞2.原代培养大鼠星形胶质细胞3.原代培养大鼠脑微血管内皮细胞4.脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经干细胞共培养5.舒脑欣滴丸含药血清对共培养神经干细胞向神经元定向分化的影响,43,建立血脑屏障模型的示意图,44,2%空白血清组,1%含药血清组,2%含药血清组,45,当今毒理学研究的热点及趋势,药物毒理学研究思路的转变,01,毒理学研究技术的进展,02,当今药物毒理学的发展趋势,03,46,将过去的临床前和临床安全性评价的药物毒理学早期研究模式转变为在新药发现阶段即对新化学实体（NCEs）进行毒理学与药效学、药动学相结合的筛选和优化的发现毒理学研究模式。将药物毒理学研究贯穿于新药开发和上市后监督与跟踪的整个过程中。,1 药物毒理学研究思路的转变,47,1.1 早期毒性筛选系统,随着物理、化学检测手段的进步，体外短期毒性筛选模型正逐步走向微型化、自动化、高通量化，并引进了大量新的检测技术和方法。检测方法：检测细胞毒性的MTT比色法、长期蛋白合成抑制试验等；检测遗传毒性的Ames波动试验、SOS显色试验、双核细胞微核试验等；体外检测睾丸毒性的大鼠精母细胞原代培养，支持细胞原代培养，原代精母细胞与支持细胞共培养，人永生化支持细胞株培养等及检测发育毒性的各种模型。干细胞的应用寻找特异的观测终点和毒性效应标志物，以及毒性作用机制。人源性（建立人干细胞的实验研究模型）,48,1.2毒理学预测范畴的新进展,毒理学和流行病学，特别是与分子流行病学相结合应用于危险度的评价，尽可能使用实际数据而不是人为的假设来确定安全系数，以提高种属之内与之间推导预测的精确性。 对致癌物质评定。 外源性化学物安全性评价的策略：构效（毒性）关系的定量分析，药效、毒性和药代动力学结合模型。,49,2 毒理学研究技术的进展,新方法和新趋势,系统毒理学,动物模型系统的应用,毒理信息学,毒代动力学,毒理基因组学,毒理蛋白质组学,毒理代谢组学,转基因动物模型和基因敲除动物模型,非哺乳类模式动物,小动物非侵入式成像技术的应用,毒理学数据库,Micro-MRI、Micro-CT和Micro-PET技术,生物发光、荧光成像技术成像技术,多样式成像系统,50,2.1 系统毒理学,系统毒理学研究策略,51,2.1 系统毒理学,系统毒理学是指通过整合分子、细胞、组织等不同研究层次的高通量信息，系统研究外源性化学物和环境应激等与机体的相互作用的一门学科。 系统毒理学系通过机体暴露后在不同剂量、不同时点的基因表达谱、蛋白质谱和代谢物谱的改变，结合传统毒理学的研究参数，借助生物信息学和计算毒理学技术，系统地研究外源性化学物和环境应激等与机体的相互作用。,52,2.1.1 毒理基因组学,毒理基因组学研究有三个主要目标：了解环境压力和人类疾病易感性的关系；鉴定有用的疾病生物标记（Biomarkers）和揭示有毒物质；阐明毒性的分子机制。应用：Syngenta公司和AstraZeneca公司的科学家设计制作了ToxBlot II平台，这是一个包含12564个cDNA的微点阵，可以灵敏地检测有害化学物质对人体基因表达的作用；用基因表达谱芯片研究中药单体苦参碱作用人红白血病K562 细胞株并诱导其分化时的基因表达谱变化, 提示苦参碱对K562 细胞株基因表达的影响以抑制细胞增殖与代谢相关基因为主, cmyc及相关基因可能是作用靶点之一。,53,2.1.2 毒理蛋白组学,研究内容包括：(1)从蛋白质角度研究外源性物质对生命有机体的毒害机制；(2)筛选特定的蛋白质作为外源性物质危险性评价的生物标志物。应用：蛋白质组学技术在中药有效单体、单味中药和中药复方的研究研究中均得到应用。如应用该技术研究中药复方黄连解毒汤对快速老化模型小鼠海马组织蛋白表达的影响，发现黄连解毒汤通过对老化相关蛋白的调节，缓解老化的进程及相应的病理变化。,54,2.1.3 毒理代谢组学,代谢组学研究生物体在病理生理刺激和遗传因素改变的条件下，在不同时间、多方位定量检测其代谢变化。应用：利用代谢组学研究Z24的毒性机制，并确定了尿液中顺乌头酸、己二酸和乳酸等代谢产物作为其肝脏毒性的生物标志物。,55,2.2 动物模型系统,转基因动物模型和基因敲除动物模型非哺乳类模式动物,56,2.2.1 转基因动物模型和基因敲除动物模型,转基因动物的基因组中含有外来遗传物质，集整体、细胞和分子水平于一体，更能体现整体研究的效果。基因敲除技术运用分子生物学的手段去除某一特定的基因制成基因敲除动物模型。通过转基因动物模型和基因敲除动物模型，特异性地表达或缺失特定基因，可以用来鉴定和评估药物的药效和毒性，转基因动物模型和基因敲除动物模型的开发将进一步提高药理学和毒理学的专一性和灵敏度，从而使新药更可靠地进入临床。,57,2.2.2 非哺乳类模式动物,非哺乳类模式动物包括线虫、果蝇和斑马鱼等。它们生物学构成相对简单，其基因和蛋白的组成和功能，细胞分化和死亡具有高度的保守性和可控性，而且其信号转导通路和关键调控点也相对有限。与传统的哺乳类动物相比，它们的易于饲养、增殖迅速和生命周期短的特点，以及在遗传学水平、生物化学水平和细胞学水平的成熟的实验技术使其可能成为药物高通量筛选的模型，用于药物对于人类的潜在毒性的研究。整体水平研究毒性，更适用于有毒中药的毒性研究。,58,2.3 小动物非侵入式成像技术,小动物非侵入式成像技术(non-invasive imaging technologies)目前已经被应用于毒性学研究，该技术具有临床前体外试验和临床试验之间的关键桥梁作用。这些技术与设备使得在同一活体实验动物上进行多时间点获得实验数据成为可能，同时减少了实验动物的使用数量。Micro-CT， Micro-PET， Micro-MRI，生物发光成像和荧光成像技术相关设备。,59,2.3 小动物非侵入式成像技术,Micro-CT,Micro-PET,Micro-MRI,Micro-CT Images,Micro-MRI Images,Bioluminescence Images,60,2.4 毒理信息学毒理学数据库,TOXNET数据库中国天然产物数据库(Chinese Natural Product Database，CNPD) 中药不良反应数据库,61,2.4 毒理信息学毒理学数据库,上述数据库中，TOXNET数据库是全球权威性的毒理学数据库，但是独立的中药毒理学数据库尚未建立。国内与中药毒理学相关的CNPD和中药不良反应数据库等，在数据收录、更