支原体检查法-中国药典2010第三部-附录XIIB

附录附录 XII B 支原体检查法支原体检查法 主细胞库 工作细胞库 病毒种子批 对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查 时 应同时进行培养法和指示细胞法 DNA 染色法 病毒类疫苗的病毒收获液 原液采 用培养法检查支原体 必要时 亦可采用指示细胞法筛选培养基 也可采用经国家药品检 定机构认可的其他方法 第一法第一法 培养法培养法 推荐培养基及其处方推荐培养基及其处方 1 支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 氯化钠 2 5g 牛肉浸液 1 2 500ml 葡萄糖 5 0g 酵母浸粉 5 0g 酚红 0 02g PH 值 7 6 0 2 于 121 灭菌 15 分钟 2 精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 氯化钠 2 5g 牛肉浸液 1 2 500ml 葡萄糖 1 0g 酵母浸粉 5 0g 酚红 0 02g L 精氨酸 2 0g PH 值 7 1 0 2 于 121 灭菌 15 分钟 3 支原体半流体培养基按液体培养基处方配制 培养基中不加酚红 加入琼脂 2 5 3g 4 支原体琼脂培养基按液体培养基处方配制 培养基中不加酚红 加入琼脂 13 0 15 0g 培养基灵敏度检查 变色单位实验法 培养基灵敏度检查 变色单位实验法 1 菌种 肺炎支原体 ATCC 15531 口腔支 原体 ATCC 23714 由国家药品检定机构分发 2 操作 将菌种接种于适宜的支原体培养基中 经 36 1 培养至培养基变色 盲 传 2 代后 将培养物接种到待检培养基中 做 10 倍系列稀释 肺炎支原体稀释至 10 7 10 9 接种在支原体肉汤培养基内 口腔支原体稀释至 10 3 10 5 接种在精氨酸支原体肉汤 培养基内 每个稀释度接种 3 支试管 置 36 1 培 养 7 14 天观察培养基变色结 果 3 结果判定 以接种后培养基管数的 2 3 以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵 敏度 液体培养基的灵敏度 肺炎支原体 ATCC 15531 株 应达到 10 8 口腔支原体 ATCC 23714 株 应达到 10 4 检查法检查法 1 供试品如在分装后 24 小时以内进行支原体检查者可贮存于 2 8 超过 24 小时应置 20 以下贮存 2 检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基 或支原体琼脂培养基 半流体培养基 或琼脂培养基 在使用前应煮沸 10 15 分钟 冷却至 56 左右 然后加 入灭能新生牛血清 培养基 血清为 8 2 并可酌情加入适量青霉素 充分摇匀 液体 培养基除无需煮沸外 使用前亦应同样补加上述成分 取每支装量为 10ml 的支原体液体培养基各 4 支 相应的支原体半流体培养基各 2 支 已冷至 36 1 每支培养基接种供试品 0 5 1 0ml 置 36 1 培养 21 天 于 接种后的第 7 天从 4 支支原体液体培养基中各取 2 支进行次代培养 每一支培养基分别 转种相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各 2 支 置 36 1 培养 21 天 每隔 3 天观察一次 3 结果判定培养结束时 如接种供试品的培养基均无支原体生长 则供试品判为 合格 如疑有支原体生长 可取加倍量供试品复试 如无支原体生长 供试品判为合格 如仍有支原体生长 则供试品判为不合格 附注 质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度 第二法 第二法 指示细胞培养法 指示细胞培养法 DNA 染色法 染色法 将供试品接种于指示细胞 无污染的 Vero 细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞 中培养后 用特异荧光染料染色 如供试品污染支原体 在荧光显微镜下可见附在细胞表 面的支原体 DNA 着色 试剂试剂 1 二苯甲酰胺荧光染料浓缩液 称取二苯甲酰胺荧光染料 5mg 加入 100ml 不 含酚红和碳酸氢钠的 Hank s 平衡液中 室温下用磁力搅拌器搅拌 30 40 分钟 使万全溶解 20 避光保存 2 二苯甲酰胺荧光染料工作液 无酚红和碳酸氢钠的 Hank s 溶液 100mL 中加入二苯甲 酰胺荧光染料浓缩液 1mL 混匀 3 固定液 醋酸 甲醇 体积比 1 3 混合溶液 4 封片液 量取 0 1mol L 枸橼酸溶液 22 2mL 0 2mol L 磷酸氢二钠溶液 27 8ml 甘油 50 0ml 混匀 调 pH 值至 5 5 培养基及指示细胞培养基及指示细胞 1 DMEM 完全培养基 2 DMEM 无抗生素培养基 3 指示细胞 已证明无支原体污染的 Vero 细胞或其他传代细胞 取培养的 Vero 细胞 经消化后 制成每 1ml 含 105 的细胞悬液 以每孔 0 5ml 接种 6 孔细胞培养板或其他容器 每孔再加无抗生素培养基 3mL 于 36 1 5 二氧化碳条件下培养过夜 备用 供试品处理供试品处理 1 细胞培养物 将供试品经无抗生素培养液至少传 1 代 然后取细胞已 长满的且 3 天未换液的细胞培养上清液待检 2 毒种悬液 如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时 应用对支原体无抑 制作用的特异抗血清中和病毒后或用不生产细胞病变的另一种指示细胞进行检查 3 其他供试品 检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细胞 测定法测定法 于制备好的指示细胞培养板中加入供试品 细胞培养上清液 2mL 毒种或 其他供试品至少 1mL 于 36 1 5 二氧化碳条件下培养 3 5 天 指示细胞培养物至 少传代 1 次 末次传代培养用含盖玻片的 6 孔培养板培养 3 5 天后 吸出培养孔中的培养 液 加入固定液 5mL 放置 5 分钟 吸出固定液 再加 5mL 固定液固定 10 分钟 吸出固 定液 使盖玻片在空气中干燥 加二苯甲酰胺荧光染料 或其他 DNA 染料 工作液 5mL 加盖 室温放置 30 分钟 吸出染液 每孔用水 5mL 洗 3 次 吸出水 盖玻片于空气中干 燥 取洁净载玻片加封片液 1 滴 分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片 用荧光显 微镜观察 用无抗生素培养基 2mL 替代供试品 同法操作 作为阴性对照 用已知阳性的供试品标准菌株 2mL 替代供试品 同法操作 作为阳性对照 结果判定结果判定