血液病标准化方案

流式细胞术的应用 血液病的诊断,血液病基础知识流式诊断血液病标准化方案,血液病基础知识,正常血细胞的发育过程,造血干细胞,红系祖细胞,原始红细胞,成熟红细胞,网织红细胞,晚幼红细胞,中幼红细胞,早幼红细胞,粒系祖细胞,原始粒细胞,分叶核细胞,杆状核粒细胞,晚幼粒细胞,早幼粒细胞,中幼粒细胞,单核系祖细胞,原始单核细胞,幼稚单核细胞,成熟单核细胞,巨核系祖细胞,颗粒巨核细胞,原始巨核细胞,幼稚巨核细胞,成熟巨核细胞,正常血细胞发育过程的抗原表达规律,期：原粒细胞阶段 期：早幼粒细胞阶段 期：中幼粒细胞阶段期：晚幼粒细胞阶段,期：原始单核细胞阶段期：幼稚单核细胞阶段期：成熟单核细胞阶段,期：原始B淋巴细胞阶段期和期：幼稚B淋巴细胞阶段 期：成熟B淋巴细胞阶段,4期：原始T淋巴细胞阶段期和期：幼稚T淋巴细胞阶段 期：成熟T淋巴细胞阶段,期：原始红细胞阶段期：幼稚红细胞阶段 III期：成熟红细胞阶段,白 血 病 分 类综合分类（FAB, 免疫性分型，染色体分型，分子生物学分型）急性白血病急性髓细胞白血病（AML) M0, M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7急性淋巴细胞白血病(ALL)T-ALL, B-ALL慢性增生性白血病慢性粒细胞白血病（CML)慢性淋巴细胞增生性白血病慢性淋巴细胞白血病（CLL)淋巴瘤其它慢性淋巴细胞增生性白血病HCL, FL, MCL等骨髓异常增生综合症（MDS)浆细胞性白血病多发性骨髓瘤（MM)浆细胞白血病（PCL),急性髓系白血病WHO分类伴遗传学异常的AML伴多系增生异常的AML治疗相关性的AML不能按照上述分类的AML (M0-M7),急性白血病一线抗体,急性白血病补充抗体,慢性淋巴增生性疾病（CLD)抗体组合,初筛：CD5，CD19，kappa，lambda；CD3，CD20，CD23,CD10，CD45B-LPD:CD22，FMC7，CD11c,CD103CD38,CD25,CD79b,HeavychainT-LPD:CD4,CD7,CD8,CD2,CD56,CD16,TCR/，TCR/,血液病基础知识流式诊断血液病标准化方案,标准化方案,方案设计标本处理标本检测结果分析,急性白血病(AL)免疫分型,骨髓增生异常综合征（MDS）,B淋巴瘤（B-LPD),T-NK淋巴瘤,浆细胞瘤（MM),T-B淋巴细胞白血病,B淋巴瘤残留病(B-MRD),霍奇金淋巴瘤,标准化方案,方案设计标本处理标本检测结果分析,标本的准备 （一）外周血、采集物或骨髓1.保存方法:抗凝管室温保存，12小时内处理标本，大于24小时，肝素抗凝4冰箱保存2.处理方法：无需特殊处理3.抗凝剂的选择：血液标本可用EDTA或肝素；骨髓标本用肝素！,（二）体 液1.保存方法：肝素抗凝管室温保存12小时内完成检测；储存在4冰箱时间应48小时。2.处理方法：新鲜标本1000rpm离心5min,弃上清后，加入PBS离心洗涤5min，加入适量PBS，必要时300尼龙网过滤后备用,（三）组织细胞1.保存方法：新鲜组织标本置于生理盐水或PBS中12小时内处理完标本。若4冰箱保存应小于48小时。2.处理方法：机械法处理组织标本！,荧光染色：（1）细胞表面抗原标记：1）根据实验方案（4色方案）加入4种荧光素（FITC、PE、PC7、PC5或APC)标记的相应抗体。2）标记：加入待检标本适量与检测管；低速涡旋混匀室温避光15min。3）溶血：加入Oplise C 溶血素0.5ml,震荡混匀，室温避光10min。4）洗涤：加入PBS适量（3ml左右）避光室温放置10min后1000rpm 5min ；5)弃上清液，加适量PBS（0.20.5ml) 混匀后上机检测，不能及时检测者置4冰箱内保持；24小时内完成检测。,（2）细胞膜和胞内抗原同时标记1）膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量骨髓标本，充分混匀后室温避光孵育15min；2）加入贝克曼破膜剂1液100ul混匀后室温避光放置15min；3）洗涤：加入PBS 1200rpm 离心洗涤5min4)加入破膜剂2液混匀后室温避光5min5）加入胞内抗体（如MPO cCD79a cCD3等）充分混匀室温避光15min;6)洗涤：加适量PBS 1200rpm 5min 离心洗涤！7）上机检测：弃去上清；加入适量PBS（200500ul）混匀上机检测；不能及时检测则4冰箱保存，24小时内完成检测。,标准化方案,方案设计标本处理标本检测结果分析,开机：启动FC500仪器；质控：选择质控程序，执行flow check；上样：根据实验项目选择相应方案模板，输入相关信息；后MCL自动上样！部分标本颗粒过多（如MRD)，需先200目过滤后再上机检测！检测过程中需要FSC /SSC门内细胞分布；若细胞分群不够清楚，需及时调整电压！,标准化方案,方案设计标本处理标本检测结果分析,免疫分型设门、分析和报告,设门：选择感兴趣的细胞分析其各参数表现常用设门方法如下：散射光（FSC/SSC)设门散射光和荧光设门CD45/SSC 设门CD19/SSC 或CD19/CD45设门m/cCD3/SSC或CD3/CD45 设门CD45/CD38或CD38/CD138设门,FSC/SSC 设门：根据FSC反应细胞大小，SSC反应细胞结构的原理；通过FSC/SSC二维点图将细胞初步分群：淋巴、单核、粒细胞；但是各区细胞有重叠，难以达到清晰分群的目的！主要初步设门！白血病的设门更多借助SSC/CD45设门法！,CD45/SSC辅助设门的原理 CD45是所有白细胞的抗原， CD45表达量在成熟淋巴细胞最高，单核细胞、粒细胞、早期造血细胞依次减弱。红细胞(中、晚幼红细胞、成熟红细胞)不表达 CD45。侧向角光散射(SSC)反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞 SSC最高，依次为单核细胞、淋巴细胞、 早期造血细胞、红细胞。以 CD45SSC典型图即可获得初步印象。若同时加上一个或二个以上其它单抗进行二、三色甚至四色分析，则很容易识别非正常细胞群的表型，并排除正常细胞的干扰，当标本中幼稚细胞低于50或检测残存白细胞时尤为必要,CD19/CD45设门用于B细胞白血病的分析CD3/CD45设门用于T细胞白血病的分析CD38/CD138设门用于MM和浆细胞瘤的分析,设门步骤：采用FSC/SSC设门R1去除碎片b.在CD45/