EDU-细胞增殖检测

荧光显微镜检测方法荧光显微镜检测方法 以以96孔板 孔板 A549贴壁细胞为例贴壁细胞为例 细胞培养细胞培养 取对数生长期细胞 以每孔4 103 1 105细胞接种于96孔板中 培养至正常生长阶段 药物处理药物处理 可选 客户可以根据实验需要进行各种药物处理 EdU 标记标记 1 1 用细胞培养基按1000 1的比例稀释 EdU 溶液 试剂 A 制备适量50 M EdU 培养 基 注 1 EdU 浓度与孵育时间相关 短时间孵育 24h 宜采用低浓度 1 10 M 2 如果需配置10 M EdU 培养基 需调整为5000 1稀释比例 3 配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质 表表1 EdU 培养基及染色反应液的使用量参考 96孔板孔板 48孔板孔板24孔板孔板12孔板孔板6孔板孔板5 5 cm 小皿小皿 EdU 培养 基 100 l150 l200 l300 l500 l2 mL 染色反应 液 100 l150 l200 l300 l500 l2 mL 注 1 表示贴壁细胞通常采用的培养容器 EdU 培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜 2 悬浮细胞 EdU 用量依据培养体积而定 1 2 每孔加入100 L 50 M EdU 培养基孵育2小时 弃培养基 注 1 最佳孵育时间与细胞周期相关 表2 大多数细胞系均可采用2小时孵育时间 2 EdU 培养基用量以没过细胞为宜 但需要保证 EdU 孵育时间内的营养物质持 续供给 表1 1 3 PBS 清洗细胞1 2次 每次5分钟 注 清洗目的是将未渗入 DNA 的 EdU 洗脱 清洗方式依据不同的细胞类型而定 贴壁 不牢的细胞请降低清洗强度 表表2 EdU 孵育时间设定参考 3T3HelaHEK293 细胞系人胚胎细胞酵母细胞 人成纤维细 胞 人宫颈癌细 胞 人胚肾细胞系人神经细胞 细胞周期 30min 3h 18h 21h 25h 5d 孵育时间5min20min2h2h2h1d 注 1 EdU 孵育时间取决于细胞周期 一般为细胞周期的1 10至1 5 但大多数细胞系均 可采用2h 孵育时间 孵育时间越长 细胞增殖数量就越多 2 考虑到细胞培养基 温度 湿度 光线等其他因素的影响 具体实验的细胞 群体细胞周期会有所变化 表表3 细胞实验 EdU 孵育浓度及时间参考 PubMed ID ReferenceCell lineConcentrationTime Salic A et al PNAS 2008NIH3T3 Hela10 nM 10 M1 hr Cappella P et al Cytometry A 2008 HL 60 A2780 U2OS 1 10 M30 min Chehrehasa F et al J Neurosci Methods 2009 Neurospheres1 20 M24 hr Limsirichaikul S et al Nucleic Acids Res 2009 Primary fibroblasts10 M1 2 4 hr Warren M et al Dev Dyn 2009Chick embryos10 M 2 mM4 hr Yu Y et al J Immunol Methods 2009Spleen cells50 M24 hr Momcilovi O et al Stem Cells 2009Human ES cells10 M30 min Cinquin O et al PNAS 2010emb 301 M12 hr Han W et al Life Sci 2009VSMC50 M2 hr Huang C et al J Genet Genomics 2010ESC50 M2 hr Hua H et al Nucleic Acids Res 2011 fission yeast strains 10 M3 hr Lv L et al Mol Cell Biochem 2011EJ cells50 M4hr Yang S et al Biol Reprod 2011GC cells50 M2 hr Zhang YW et al Nucleic Acids Res 2011U2OS HT2930 M90 min Guo T et al PloS One 2011HIT T1550 M4hr Zeng T et al PloS One 2011MCF 10A25 M2hr Ding D et al Int Orthop 2011C3H10T1 210 M24hr Zeng W et al Biomaterials 2011EPC50 M4hr Xue Z et al J Cell Biochem 2011SGC790125 M24hr Peng F et al Lasers Med Sci 2011MSC50 M2hr Li D et al J Biol Chem 2011HCC50 M2hr 注 如果您有采用 BrdU 进行实验的经验 可以参照 BrdU 实验的相关参数进行 EdU 实验 细胞固定化细胞固定化 2 1 每孔加入50 L 细胞固定液 即含4 多聚甲醛的 PBS 室温孵育30分钟 弃固定液 注 1 低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持 当需要抗体染色时 需采用 Triton X 100透化细胞以利于抗体进入细胞内 2 可采用其他方式进行细胞固定 2 2 每孔加入50 L 2 mg mL 甘氨酸 脱色摇床孵育5分钟后 弃甘氨酸溶液 注 目的是中和多聚甲醛 保证染色反应体系 当采用其他方式进行细胞固定时可酌情 省略此步骤 2 3 每孔加入100 L PBS 脱色摇床清洗5分钟 弃 PBS 2 4 加强 每孔加入100 L 渗透剂 0 5 TritonX 100的 PBS 脱色摇床孵育10分钟 PBS 清洗1次 5分钟 注 当实验需要进行其他抗体染色时 或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高 可能 需要增强细胞膜通透性 普通细胞可以省略 Apollo 染色染色 3 1 每孔加入100 L 的1X Apollo 染色反应液 表3 避光 室温 脱色摇床孵育30分 钟后 弃染色反应液 注 1 染色液用量与细胞量相关 以覆盖细胞为宜 表1 2 孵育时间可以进行适当调整 调整范围为10 30分钟 表表4 Apollo 染色反应液的配置参考 现用现配 配配制制顺顺序序Apollo 染染色色反反应应液液500 L 1 mL5 mL10 mL 1去离子水469 L938 L4 69 mL9 38 mL 2Apollo 反应缓冲液 试剂B 25 L50 L250 L500 L 3Apollo 催化剂溶液 试剂C 5 L10 L50 L100 L 4Apollo 荧光染料溶液 试剂 D 1 5 L3 L15 L30 L 5Apollo 缓冲添加剂 试剂E 5 mg9 mg44 mg88 mg 注 1 表示通常配制的 Apollo 反应液的体积足以进行5 10个孔 96孔板 染色 2 按顺序配制适量1X Apollo 染色反应液 以免破坏正常的反应体系 现用现配 30分钟用完 3 试剂 E 为白色粉末 较易氧化 使用后请旋紧管盖 如试剂出现棕黄色 则 需更换 粉末较难准确称量 称量误差范围可稍微放宽 但不应超过 20 3 2 加入100 L 渗透剂 0 5 TritonX 100的 PBS 脱色摇床清洗2 3次 每次10分钟 弃渗透剂 3 3 加强 每孔每次加入100 L 甲醇清洗1 2次 每次5分钟 PBS 清洗1次 每次5分钟 注 由于某些细胞对染料的吸附性较高 需采用加强方式洗脱以降低染料背景 普通实 验可以省略 DNA 染色染色 4 1 用去离子水按100 1的比例稀释试剂 F 制备适量1X Hoechst33342反应液 避光 保存 4 2 每孔加入100 L 1X Hoechst 33342反应液 避光 室温 脱色摇床孵育30分钟后 弃染色反应液 4 3 每孔每次加入100 L PBS 清洗1 3次 4 4 客户可选择进行其他染色步骤 否则每孔加入100 L PBS 保存待用 其他染色其他染色 自备自备 可选 客户可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色 注 染料兼容性请 参照表4 图像获取及分析图像获取及分析 建议染色完成后立即进行观测 如果条件限制 请避光 4 湿润保存待测 但不应超过3 天 注 调试仪器时 请将曝光时间调整为30ms 左右 尽量不要 1s 表表5 配套染料的相关波长信息 C000