利用酵母菌发酵生产细胞色素C工艺设计—课程设计说明书 - 目录完整版

中北大学课程设计说明书 发酵工程课程设计说明书 利用酵母菌发酵生产细胞色素 C 的工艺设计 学生姓名 曹志钦 学号 1104064103 学 院 专 业 指导教师 2013 年 12 月 化工与环境学院 生物工程 贾万利 中北大学课程设计说明书 目录 1 绪论 1 1 1 引言 1 1 1 1 细胞色素 C 的作用 1 1 1 2 酵母菌的特性 1 1 2 课程设计的目的 1 1 3 课程设计的任务及要求 2 2 酵母菌生产工艺设计 3 2 1 酵母菌的选取 3 2 1 1 含微生物材料采集 3 2 1 2 标本材料的预处理 3 2 1 3 所需菌种的分离 4 2 1 4 酵母菌菌株纯种的鉴定 4 2 1 5 菌株的诱变处理 4 2 1 6 菌种初筛 5 2 1 7 菌种的复筛 5 2 2 菌种的保藏 5 2 2 1 菌种保藏的意义 6 3 培养基的配制 7 3 1 培养基的营养要求 7 3 1 1 碳源 7 3 1 2 氮源 7 3 1 3 无机盐及微量元素 7 3 1 4 水 7 3 1 5 生长因子 前体 产物促进剂和抑制剂 8 3 2 培养基的种类 8 3 2 1 孢子培养基 8 3 2 2 种子培养基 8 3 2 3 发酵培养基 8 4 灭菌 10 4 1 灭菌的方法 10 4 2 培养基的连续灭菌 10 4 3 空气灭菌 11 5 种子扩大培养 13 5 1 种子制备工艺 13 5 1 1 孢子制备 13 5 1 2 实验室种子阶段 13 5 1 3 生产车间种子制备阶段 13 5 2 种子质量的控制措施 14 6 发酵工艺控制 15 6 1 发酵的分类 15 中北大学课程设计说明书 6 2 发酵条件的影响及控制 15 6 2 1 基质浓度 15 6 2 2 灭菌情况 15 6 2 3 种子的质量 15 6 2 4 温度对发酵过程的影响 16 6 2 5 pH 对发酵过程的影响 16 6 2 6 溶氧对发酵过程的影响 17 6 2 7 CO2 对发酵的影响 17 6 2 8 发酵过程泡沫的控制 17 7 发酵计算 18 7 1 发酵罐的结构 18 7 2 细胞色素 C 发酵通常采用机械搅拌通风发酵罐 18 7 2 1 常用的机械搅拌通风发酵罐几何比例 18 7 2 2 工艺计算 18 7 2 3 物料衡算 19 7 2 4 种子罐的设计 19 8 放罐及染菌防治 21 8 1 发酵终点的判断 21 8 2 发酵染菌的防治与处理 21 9 下游加工 22 9 1 发酵液的过滤和预处理 22 9 2 细胞破碎 22 9 3 细胞色素 C 的提纯 23 9 4 成品加工与包装 23 10 总结 24 参考文献 25 中北大学课程设计说明书 第 0 页 共 26 页 1 1 绪论绪论 1 11 1 引言引言 细胞色素 C 是一种以铁卟啉为辅基的呼吸酶 是细胞呼吸激活剂 属于络合 蛋白质 由多肽与血色素络合而成 血色素是铁的衍生物 具氧化还原的可逆性 从而导致细胞色素 能在生理氧化反应过程中表现出电子传导 即 Fe2 Fe3 的效能 以促进细胞的氧化反应 达到兴奋呼吸目的 它在生物氧 化过程中 是一个非常重要的电子传递体 亲缘关系越近的生物 其细胞色素 C 越相似或相同 比如人和黑猩猩 而如果在进化史上相去甚远 则其细胞色素 C 也相差越远 比如人和酵母菌 鉴于细胞色素 C 分子在呼吸电子传递链中不可或 缺的地位 其分子结构是相对保守的 但随着生物的进化 其分子组成结构也必 将出现变异 只是相对于其他蛋白来说 细胞色素 C 分子的很多变异可能导致生 物体的电子传递出现问题而导致死亡 因此 其分子进化要缓慢而保守 通常外 源性细胞色素 C 不能进入健康细胞 但在缺氧时 细胞膜的通透性增加 细胞色 素 C 便有可能进入细胞及线粒体内 增强细胞氧化 能提高氧的利用 有关细胞 凋亡的研究表明 细胞色素 C 与细胞凋亡有关 从线粒体中泄露出的细胞色素 C 有诱导细胞凋亡的作用 本次设计内容为利用酵母菌生产细胞色素 C 主要通过 采用富集培养 结合平板划线 涂布等手段成功的从活性污泥中分离筛选到高产 细胞色素 C 的酵母菌 之后发酵生产细胞色素 C 后期采用二氧化碳超声波萃取 等方法提取细胞色素 C 达到最佳的生产效果 降低成本 1 1 11 1 1细胞色素细胞色素 C C 的作用的作用 用途一 来自三羧酸循环产生的琥珀酸辅酶 A 其肽链仅有104个氨基酸 体内大量存在 无需外源补充 细胞色素 C 是生物氧化的非常重要的电子传递体 在线粒体崤上与其它氧化酶排列成呼吸链 参与细胞呼吸过程 肝细胞炎症时细 胞膜通透性较高 细胞色素 C 可进人细胞内 可治疗肝衰竭 增加细胞氧化 提 高氧利用 是含铁的结合蛋白 有抗原 用途二 细胞呼吸激活药 对组织中细胞的氧化 还原过程具有迅速的酶 促作用 用于急救或辅助治疗中因各种原因引起的组织缺氧 对抗癌药物引起的 白血球降低 四肢循环障碍 肝疾患 肾炎亦有一定的治疗作用 1 1 21 1 2酵母菌的特性酵母菌的特性 酵母菌是人类直接食用量最大的一种微生物 酵母菌体含有丰富的蛋白质 脂肪 细胞色素 C 糖分 B 族维生素 酶 辅酶 核糖核酸 甾醇和一些新陈代 谢的中间产物 在医药工业中 酵母菌及其制品用于治疗某些消化不良症 并能 提高和调整人体的新陈代谢机能 因此 药用酵母菌的生产在酵母工业中占有重 要的地位 此外 因为酵母菌体内富含细胞色素 C 核酸 谷胱甘肽等生理活性 物质 可以从酵母菌体内提取细胞色素 C 利用发酵生产的细胞色素 C 大大降低 了其成本并且能为医疗方面做出重大贡献 1 21 2 课程设计的目的课程设计的目的 中北大学课程设计说明书 第 1 页 共 26 页 通过本课程设计 进一步掌握 发酵工程 课程的基本知识 掌握发酵工艺 设计要点及其相关工程设计要点 具备初步的发酵工程工艺及设备的独立设计能 力 培养生物工程专业学生综合运用所学的理论知识独立分析和解决发酵工程实 际问题的实践能力 1 31 3 课程设计的任务及要求课程设计的任务及要求 设计任务 完成年产 5 吨细胞色素 C 发酵的生产工艺 其中包括菌种选育 培养基的设计及灭菌 空气除菌 如为需氧发酵 种子的扩大培养 设备的选用 发酵过程中的控制参数和下游加工等 设计要求 按照年产量要求进行工艺设计 不得造成设备浪费 节约人力 物力和能源 进行简单的物料衡算 绘制设计图 要求一张工艺流程图和一张主设备结构图 A4 纸打印 中北大学课程设计说明书 第 2 页 共 26 页 2 2 酵母菌生产工艺设计酵母菌生产工艺设计 酵母菌主要的生长环境是潮湿或者液态的环境 有些酵母菌也会在生物体内 所以需要根据实际需要选取所需的合适菌种 如何从多样的酵母菌中选择一种可 以用于工业生产的 性质稳定的菌株是非常重要的 也是决定工业发酵成败的关 键之一 根据酵母菌发酵生产的总体特点 设计菌株的选择性分离的步骤 含微生物 材料采集 标本材料的预处理 菌种的分离 富集培养 菌株诱变 菌种初选 菌种复选 性能鉴定 菌种保藏 2 12 1 酵母菌的选取酵母菌的选取 2 1 12 1 1 含微生物材料采集含微生物材料采集 土壤由于具备了微生物所需的营养 空气和水分等条件 所以是微生物最集 中的地方 从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株 空气 水中的微生物也都 来源于土壤 所以土壤样品往往是首选的采集目标 一般情况下 土壤中含细菌 数量最多 且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律 细菌 108 放线菌 107 霉菌 106 酵母菌 105 藻类 104 原生动物 103 其中放线菌 和霉菌指其孢子数 但各种微生物由于其生理特性不同 在土壤中的分布也随着 地理条件 养分 水分 土质 季节而有很大的变化 据有关资料的显示 性能 研究 性能优异 为了可以选择好的菌种 潮湿或液态环境土壤是很好的选择 酵母菌在自然界中分布很广 尤其喜欢在偏酸性且含糖较多的环境中生长 例如 在水果 蔬菜 花蜜的表面和在果园土壤中最为常见 取样时先除去表层5cm表土 取5 15cm深的土壤 5处采集 每份样品重约 500g 给塑料袋编号并记录地点 土壤质地 植被名称 时间及其他环境条件 得到来自果树下腐叶土的01号 09号土样 2 1 22 1 2 标本材料的预处理标本材料的预处理 因为我们所选择的菌株是在潮湿或液态环境下有利生存 因此在对材料的预 处理中 我们应该同样置材料于潮湿或液态环境下 加入一些物质促进酵母菌的 生长 抑制其它细菌的生长 保证所需菌种的生长条件 阻止其它的菌种的优势 中北大学课程设计说明书 第 3 页 共 26 页 生长 对样品进行处理 调节pH为5 0 在30 条件下 加热20分钟 即可除去部分 细菌 利于分离得到所需要的菌株 2 1 32 1 3 所需菌种的分离所需菌种的分离 大多数酵母菌为腐生 其生活最适pH为4 5一5 常见于含糖分较高的环境中 例如果园土 菜地土及果皮等植物表面 酵母菌生长迅速 易于分离培养 在液 体培养基中 酵母菌比霉菌生长得快 根据酵母菌喜欢酸性环境的特点 利用上述酸性液体培养基 这样做的好处 是酸性培养条件则可抑制细菌的生长 在30 下培养4小时 产生一些菌落 用 变色圈法分离 从培养基中挑取一些较大较厚 呈乳白色或红色 表面湿润 粘 稠的菌株 即得到所需初级菌种 2 1 42 1 4 酵母菌菌株纯种的鉴定酵母菌菌株纯种的鉴定 把分离纯化到的酵母菌接到液体培养基平板中 在 30 下各培养 24 48h 若 液体管内不出现浑浊 平板上不长出杂菌菌落 同时菌株在平板培养基上又可形成 均一具特征性的单菌落 再结合镜检无异样细胞发现 即可证明获得的菌株为纯培 养物 2 1 52 1 5 菌株的诱变处理菌株的诱变处理 诱变处理的理论基础是基因突变 所谓突变是指由于染色体和基因本身的遗 传性状的变异 从自然界获得的菌种 通过进一步的菌种选育 可以为发酵提供 各种类型的突变株 提高发酵单位 还可以改进产品质量 去除多余的代谢产物 和合成新品种 有利于经济效益的提高 本次菌株的诱变处理采用物理诱变处理 法 紫外线诱变 菌悬液的制备 选择培养好的斜面 加入 10ml 无菌水 用吸管将孢子轻 轻刮下后吸出 用研磨器将菌悬液研磨 得到单细胞菌悬液 用血球计数板计算 孢子数在 20 30 亿个 ml 1 菌悬液的预培养 取 10ml 研磨后的菌悬液接入装量为 25ml 的液态斜面 培养基中预培养 2h 紫外诱变 将预培养的单细胞菌悬液加入平皿中 每皿 1ml 用磁力搅拌 器缓慢搅拌菌悬液 在红外光下操作 用 30W 紫外灯管 距离 25cm 照射 中北大学课程设计说明书 第 4 页 共 26 页 30sec 5min 在照射受试菌前 灯管须预热 20min 照射后平皿用黑布包严 防 止发生可见光的修复作用 培养 用吸管吸取诱变后的孢子悬液 稀释 10 1 10 3 倍涂布细胞色素 C 性平皿 用三角耙把菌液涂匀 单菌落于 30 培养 14 18 天 第二天倒置培 养 得到诱变后的目的的菌株 2 1 62 1 6 菌种初筛菌种初筛 用于生产的菌株必须要有一定的生活能力和生产能力 所获得的菌株需要经 过一定的手段进行检测 其符合规定后才能作为生产菌种来使用 将各诱变处理后的待测菌株接种在固体培养基斜面上 活化3代 每代24h 取各菌株以相同量接种于液体培养基试管中 装样量5mL 在30 培养箱中静置 24h 再将装有增殖菌株的各试管内液体倒入装有60 mL 发酵培养基的三角烧瓶中 用纱布封口 于30 摇床 转速140r min 培养15h 即可得到一些所需的菌种 挑选性能优良菌落 传代培养2 3代 斜面保藏备用 2 1 72 1 7 菌种的复筛菌种的复筛 将用分离培养得到的菌种实验室中保藏的某些菌种筛选 选取菌株生长状况 比较好的菌落 分别编号 选取 10 株 做标记 分别为 Y1 Y10 进行发酵培 养基和发酵条件优化的研究 2 22 2 菌种的保藏菌种的保藏 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点 人工创造条件 使孢子或菌体的 生长代谢活动尽量降低 以减少其变异 一般可通过保持培养基营养成分在最低 水平 缺氧状态 干燥和低温 使菌种处于 休眠 状态 抑制其繁殖能力 常 用的菌种宝藏方法有 斜面冰箱保藏法 沙土管保藏法 菌丝速冻法 石蜡油封 法 真空冷冻干燥保藏法 液氮超低温保藏法 在这里我们采用沙土保藏法 方法 将需保藏的菌种经斜面培养后用无菌水制成孢子悬液 加入经灭菌处 理的沙和土的混合物 或纯沙亦可 作为载体 减压抽去水分 这些吸附有孢子 的干燥沙土载体 在低温下保存 操作步骤 斜面孢子先加灭菌蒸馏水 2 2 5ml 沿斜面轻刮孢子后 再吸 中北大学课程设计说明书 第 5 页 共 26 页 0 2 0 3 ml 到灭菌备用的沙土管中 在真空度 100 Pa 以下进行干燥 直至沙土 管外貌呈松散状态 然后低温 4 保存 经真空干燥后的沙土管 最好放在密 闭容器内 容器内可放硅胶等 保藏期间整个容器置于冰箱内 一般保存期为一 年左右 2 2 12 2 1 菌种保藏的意义菌种保藏的意义 菌种保藏是进行微生物研究和微生物育种工作的重要组成部分 其首要任务 是使菌种不死亡 同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的 方面发展 中北大学课程设计说明书 第 6 页 共 26 页 3 3 培养基的配制培养基的配制 3 13 1 培养基的营养要求培养基的营养要求 3 1 13 1 1 碳源碳源 碳源是组成培养基的主要成分之一 主要功能有两个 一 为微生物菌种的 生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分 二 为合成目的产物提供所必需 的碳成分 常用的碳源有糖类 油脂 有机酸和低碳醇等 可分为速效碳源和长 效碳源 糖类是发酵培养基中最为广泛应用的碳源 主要有葡萄糖 糖蜜和淀粉 糊精等 糖蜜是制糖生产时的结晶母液 而且它是制糖工业中的副产物 糖蜜中 含有丰富的糖 氮类化合物 无机盐和维生素等 是微生物发酵培养基价廉物美 的碳源 这种糖蜜主要含有蔗糖 总糖可达 50 75 一般地 糖蜜分为甘蔗糖 蜜和甜菜糖蜜 二者在糖的含量和无机盐的含量上有所不同 即使同一种糖蜜由 于其加工方法的不同其成分也存在或多或少的差异 如下表所示 因此 要注意 合理选择 3 1 23 1 2 氮源氮源 用于构成细胞菌体物质 氨基酸 蛋白质 核酸等 常用的氮源可分为两类 有机氮源 黄豆饼粉 玉米浆 蛋白胨 酵母粉 鱼粉等 无机氮源 铵盐 硝 酸铵和氨水等 不同氮源以鱼粉最好 辅加氮源以硝酸铁为佳 氨水在发酵中除 可调节 pH 外 也是一种容易利用的氮源 在抗生素的生产中得到广泛应用 氨水 碱性较强 使用时要防止局部过碱 应加搅拌的强度 并且注意应该少量多次加 入 3 1 33 1 3 无机盐及微量元素无机盐及微量元素 成分 NaCl 其主要作用是改变细胞外的渗透压 从而改善传质效果 但 Cl 或 Na 浓度过高会对微生物产生毒性 CaCO3 5 17g L 稳定发酵液的 pH 值 中和代谢过程中产生的酸性物质 MgSO4 0 25 3 0 g L 作为微量元素 可能 与某些酶的活性或一些物质的运输有关 Mg3 PO4 2 在 0 0 1 0 的范围内 中北大学课程设计说明书 第 7 页 共 26 页 Mg3 PO4 2浓度越高 细胞色素 C 发酵效价越高 但更高的 Mg3 PO4 2加量对细胞色 素 C 发酵的影响不明显 在生产中需要通过试验预先了解菌种对无机盐和微量元 素的最适需求量 以稳定或提高产量 常用无机盐的浓度查阅新编生物工艺学 P104 3 1 43 1 4 水水 水是所有微生物的主要组成成分 也是微生物机体的重要组成成分 它还是 一切营养物质传递的介质 而且它还直接参与许多代谢反应 不同来源的水 如 深井水 自来水 地表水 所含的物质不同 因此水的质量对微生物生长会产生 一定的影响 水源质量的主要考虑参数包括pH值 溶解氧 可溶性固体 污染程 度以及矿物质的组成和含量 在发酵工业中 一个高单位的生产菌种也会因水质 不同而导致其在异地不能发挥其生产能力 所以水的选取尤其值得注意 不能大 意 3 1 53 1 5 生长因子 前体 产物促进剂和抑制剂生长因子 前体 产物促进剂和抑制剂 生长因子是微生物生长不可缺少的有机物质 如氨基酸 嘌呤 嘧啶 维生 素等均称生长因子 氨基酸是一种有机氮源 同时也可以作为一种生长因子 在 生产实践中因为氨基酸价格比较昂贵 且许多有机氮源中如玉米浆中含有一定量 的氨基酸 能够满足发酵的需要 所以常用玉米浆代替氨基酸在工业生产培养基 中使用 前体是能直接被微生物在生物合成中结合到产物分子中去 而自身的结 构没有多大变化的化合物 但产物的产量却因加入前体而有较大的提高 促进剂 是指那些非细胞生长所需的营养物质 又非前体 但加入后能提高产品产量的添 加剂 3 23 2 培养基的种类培养基的种类 培养基可以按照用途可以分成孢子培养基 种子培养基和发酵培养基 3 2 13 2 1 孢子培养基孢子培养基 孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的 常采用的是固体培养基 对这 类培养基的要求是能使菌体生长快速 产生数量多而优质的孢子 并且不会引起 菌体变异 对孢子培养基的要求 营养不要太丰富 所用无机盐的浓度要适 量 注意培养基的 pH 和湿度 斜面 分离培养基 g L 蔗糖 60 酵母粉 20 蛋白胨 10 琼脂 20 中北大学课程设计说明书 第 8 页 共 26 页 自来水配制 pH 5 3 2 23 2 2 种子培养基种子培养基 种子培养基是供孢子发芽 生长和大量繁殖菌丝体 并使菌丝体长得粗壮成 为活力强的种子 对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全 氮源和维生素的 含量也比较高些 浓度以稀薄为好 可以达到较高的溶解氧 供大量菌体生长和 繁殖 细胞色素 C 的种子培养基的配比为 g L 蔗糖 10 5 硫酸铵 0 1 磷酸二 氢钾 0 1 七水硫酸镁 0 04 pH 5 3 2 33 2 3 发酵培养基发酵培养基 发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求 使菌种迅速生长 健壮 能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能 力 但要注意成本和能耗 细胞色素 C 的发酵培养基配比为 g L 蔗糖 10 5 蛋白胨 10 酵母粉 5 NaCl 10 KCl 1 8 酵母膏 2 5 醋酸 8 2 培养基灭菌后 接入种子 搅拌 28 通风量 0 8vvm 培养 3d pH 6 中北大学课程设计说明书 第 9 页 共 26 页 4 4 灭菌灭菌 原理 对数残留定律 N N0 e kt 灭菌结束时 培养基中的活微生物数一般 为 0 001 个 4 14 1 灭菌的方法灭菌的方法 化学灭菌 射线灭菌 干热灭菌 湿热灭菌 过滤灭菌 4 24 2 培养基的连续灭菌培养基的连续灭菌 本次条件为在 121 表压约 0 1MPa 维持 30 分钟 将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热 保温 降温的灭菌过程 称为 连续灭菌 特点是高效 快速 连续灭菌时培养基在短时间内被加热到灭菌温度 短时间保温后被快速冷却 再进入早已灭完菌的发酵罐 这样可以减少对培养基 的破坏 提高发酵设备利用率 实现自动控制 培养基连续灭菌设备流程如图 4 1 所示 中北大学课程设计说明书 第 10 页 共 26 页 M M PIS TC 至发酵罐 配料罐预热桶送料泵连消泵加热器维持罐喷淋冷却器 原料 图 4 1 培养基连续灭菌设备流程 影响灭菌效果的因素 微生物的种类和数量 培养基性质 浓度 成分 灭菌的温度 时间 热阻 微生物对热的阻抗能力 培养基灭菌之前 先对种子罐 发酵罐等其他设备进行空罐灭菌 灭菌条件为 121 表压约 0 1MPa 维持 30 分钟 4 34 3 空气灭菌空气灭菌 细胞色素 C 的生产属于好氧发酵 所以制备无菌空气至关重要 发酵用的无 菌空气就是将自然界的空气经过压缩 冷却 减湿 过滤等过程 空气除菌的流 程图如图 4 2 所示 中北大学课程设计说明书 第 11 页 共 26 页 图 4 2 空气除菌设备流程图 流程如下 采风塔 空气粗过滤器 空气压缩机 储气罐 冷却器 旋风分 离器 冷却器 丝网除沫器 空气加热器 总空气过滤器 设备如下 采风塔 采风塔建在工厂的上风头 高至少 10 m 气流速度 8 m s 粗过滤器 主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机 同时起一 定的除菌作用 减轻总过滤器的负担 空气压缩机 作用是提供动力 以克服随后各设备的阻力 空气储罐 作用是消除压缩空气的脉动 要求 H B 2 2 5 V 0 1 0 2 V1 其中 H 为罐高 B 为罐直径 V1为空压机每分钟排气量 20 1 105Pa 状况下 旋风分离器 是利用离心力进行气 固或气 液沉降分离的设备 作用是分离 空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子 冷却器 空压机出口温度气温在 120 左右 必须冷却 另外在潮湿的地域 和季节还可以达到降湿的目的 丝网除沫器 可以除去空气中绝大多数的 20 m 以上的液滴和 1 m 以上的雾 滴 一般采用规格为直径 0 25 40 孔且高度为 150 的不锈钢丝网 空气加热器 列管内走空气 管外走蒸汽 可将空气湿度由 100 降低到 70 以下 总过滤器 填充物按下面顺序安装 孔板 铁丝网 麻布 活性炭 麻布 棉花 麻布 铁丝网 孔板 介质要紧密均匀 压紧一致 上下棉花层厚度为总 过滤层厚度的 1 4 中间活性炭层为 1 3 过滤是空气除菌的主要手段 按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类 绝对 过滤 相对过滤 后者主要原理为 1 惯性滞留作用 2 拦截滞留作用 3 布朗扩 散作用 4 重力沉降 5 静电作用 中北大学课程设计说明书 第 12 页 共 26 页 5 5 种子扩大培养种子扩大培养 作为种子的准则是 菌种细胞的生活力强 移种至发酵罐后能迅速生长 迟缓期短 生理性状稳定 菌种总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求 无杂菌污染 保持稳定的生产能力 种子的制备主要包括实验室种子的制备和 种子的扩大培养两个阶段 细胞色素 C 采用二级发酵 其流程为 沙土管 孢子斜面培养基 摇瓶液体 培养基 种子罐 发酵罐 发酵液 5 15 1 种子制备工艺种子制备工艺 种子扩大培养是指将保存在砂土管 冷冻干燥管处于休眠状态的生产菌种接 入试管斜面活化后 再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和 质量的纯种的过程 包括 实验室种子制备阶段 包括琼脂斜面 固体培养基 扩大培养或摇瓶液体培养 生产车间种子制备阶段 如种子罐扩大培养 5 1 15 1 1 孢子制备孢子制备 中北大学课程设计说明书 第 13 页 共 26 页 保藏在沙土管或冷冻干燥管中的菌种经无菌手续接入适合孢子发芽或菌丝生 长的斜面培养基中 培养成熟后挑选菌落正常的孢子用摇瓶液体培养 在摇床上 恒温振荡培养 获得菌丝体作为种子 5 1 25 1 2 实验室种子阶段实验室种子阶段 取保藏菌种 将其在固体斜面培养基中 2 3 个月移种一次 培养一段时间 然后再转移到摇瓶培养 然后放在摇床上恒温培养 从活化的斜面上挑取两环菌 种接入种子培养基 摇瓶种子培养采用 250mL 的锥形瓶 装液量 80mL 接种量 10 8mL 瓶口用棉花塞住 摇床转速 120rpm 温度 30 培养 18 24h 5 1 35 1 3 生产车间种子制备阶段生产车间种子制备阶段 将筛选得到的菌种用于工业生产还必须经过种子的扩大过程 也就是生产种 子的制备 因发酵生产的不同 生产种子一般可分为一级种子制备 二级种子制 备和三级种子制备 本设计的细胞色素 C 发酵中采用一级种子制备 二级发酵 一级种子制备 是指将来自摇瓶培养的菌体 打开接种口在火焰保护下接种 到 1m 种子罐中培养 接种量为种子罐内的培养基量的 10 培养 18h 以备发酵 接种使用 一级种子制备的培养温度均为 30 转速为 150rpm 通气量为 1vvm 5 25 2 种子质量的控制措施种子质量的控制措施 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中说表现的生产能力 因此首先必须 保证生产菌种的稳定性 其次是提供种子培养的适宜环境 保证无杂菌侵入 以 获得优良种子 主要包括菌种稳定性检查和无杂菌检查 在接种过程中所有设备 和培养基必须经过灭菌 在种子罐培养中要严格控制罐温 罐压 并定时取样做 无菌试验 观察菌体形态 测定罐内种子液的发酵单位并对其进行生化分析 观 察有无杂菌情况 只有种子质量合格 浓度达到 108个 mL 水平时才可移出接种到 发酵罐中发酵 中北大学课程设计说明书 第 14 页 共 26 页 6 6 发酵工艺控制发酵工艺控制 6 16 1 发酵的分类发酵的分类 微生物发酵过程可分为分批 补料 分批 半连续和连续等几种方式 分批发酵是一种准封闭式系统 种子接种到培养基后除气体流通外发酵液始 终留在生物反应器内 补料 分批发酵是在分批发酵过程中补入新鲜的料液 以克服由于养分的不足 导致过早结束 由于只有料液的输入 没有输出 因此 发酵液的体积在不断增 加 半连续发酵是在补料 分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液便可称为半 连续发酵 考虑到补料 分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足 但由于有 害代谢物的不断积累 产物合成最终难免受到阻遏 放掉部分发酵液 再补入适 当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释 从而有利于产物的继续合成 中北大学课程设计说明书 第 15 页 共 26 页 连续发酵是发酵过程中一边补入新鲜的料液 一边以相近的流速放料 维持 发酵液原来的体积 本设计采用分批发酵 6 26 2 发酵条件的影响及控制发酵条件的影响及控制 6 2 16 2 1 基质浓度基质浓度 基质浓度必须严格控制 培养基过于丰富 会使菌体生长过于旺盛 发酵液 非常粘稠 传质状况很差 细胞不得不花费许多能量来维持其生存环境 即用于 非生产的能量倍增 对发酵不利 6 2 26 2 2 灭菌情况灭菌情况 培养基的灭菌情况对不同品种的发酵生产的影响是不一样的 一般 随着灭 菌温度的升高 时间的延长 对养分的破坏作用越大 从而影响菌体的生长 特 别是葡萄糖 不宜同其它养分一起灭菌 6 2 36 2 3 种子的质量种子的质量 发酵期间生产菌种生长的快慢很大程度上取决于种子的质和量 具体的反映 在接种龄和接种量上 接种龄是指种子罐中培养的菌体开始移种到下一级种子罐或发酵罐的培养时 间 一般 接种菌龄以对数生长期的后期 即培养液中菌浓度接近高峰时所需的 时间较为适宜 太年轻的种子接种后往往会出现前期生长缓慢 整个发酵周期延 长 产物开始形成时间推迟 过老的种子虽然菌量较多 但接种后会导致生产能 力的下降 菌体过早自溶 接种量是指移种的种子液体积和培养液体积之比 一般 发酵常用的接种量 为5 10 接种量的大小是由发酵罐中菌的生长繁殖速度决定的 通常 采用较 大的接种量可以缩短生长达到高峰的时间 使产物合成提前 比较节省时间 这 是由于种子量多 同时种子液中含有大量胞外水解酶类 有利于基质的利用 并 且生产菌在整个发酵罐内迅速占优势 从而减少杂菌生长的机会 但是 如接种 量过大 也可能使菌种生长过快 培养液粘度增加 导致溶氧不足 影响产物合 成 对于大规模培养有一定的局限性 6 2 46 2 4 温度对发酵过程的影响温度对发酵过程的影响 中北大学课程设计说明书 第 16 页 共 26 页 温度对发酵的影响主要表现在以下四个方面 1 温度对微生物菌体的生长 呼吸以及产物合成影响程度不同 2 温度影响发酵过程中基质和营养物溶解的速率和气体的传递效率 3 温度影响生物合成的方向 4 温度影响代谢调控 在菌体生长期 保持较高的温度 酶反应速率增大 有利于菌体快速生长 从而可以缩短生长期 但酶本身很容易因过热而失去活性 使菌体容易衰老 发 酵周期缩短 控制发酵 0 24h 培养温度为 28 菌体基础代谢较快 营养物质 消耗也快 所以 要注意营养的及时补充 6 2 56 2 5 pHpH 对发酵过程的影响对发酵过程的影响 pH 是微生物生长和产物合成的最重要的状态参数 pH 的变化会影响各种酶活 菌对基质的利用速率和细胞的结构 从而影响菌的生长和产物的合成 大多数微 生物的生长适应的 pH 跨度为 3 4 个 pH 单位 最佳生长 pH 跨度在 0 5 1 个单位 酵母菌的最适范围在 4 5 其生长和产物合成阶段的最适 pH 通常是不一样的 控制 pH 在合适范围应首先从基础培养基的配方考虑 然后通过加酸或碱或中间补 料来控制 如 pH 上升超过最适值时 意味着菌体处于饥饿状态 可加葡萄糖 pH 下降时 可加尿素 过滤的氨水 用氨水中和有机酸时需谨慎 过量的氨水会使 微生物中毒 导致呼吸强度急速下降 6 2 66 2 6 溶氧对发酵过程的影响溶氧对发酵过程的影响 溶氧是微生物生长所必需的 溶氧是影响细胞色素 C 发酵的重要因素 溶氧 太低会使糖代谢缓慢 菌体生长不良 产物合成受阻 溶氧太高则使菌体生长过 于旺盛 底物完全氧化的比例过高 也不利于细胞色素 C 的合成 对溶氧的控制 还应考虑底物的浓度 在不同的底物浓度下应有不同的溶氧水平 底物浓度较高 时 增加 DO 可以加强菌体的代谢活性 不会因为基质的完全氧化降低产量 底物 浓度较低时 过高的溶氧会导致基质的完全氧化而降低细胞色素 C 的产量 DO 水 平应该保持在 50 以下 6 2 76 2 7 COCO2 2 对发酵的影响对发酵的影响 溶解在发酵液中的CO2对发酵有抑制或刺激作用 大多数微生物适应低浓度 CO2 当尾气CO2浓度高于4 时 微生物的糖代谢与呼吸速率下降 呼吸商RQ CO2释 中北大学课程设计说明书 第 17 页 共 26 页 放率 摄氧率 可以判断菌的生长 呼吸情况 还可以反映菌的代谢情况 6 2 86 2 8 发酵过程泡沫的控制发酵过程泡沫的控制 酵母菌的菌体生长过程是好氧性培养 培养过程中要通入大量的无菌空气 为了增加发酵培养基中溶解氧的浓度 还要进行搅拌 将大气泡打碎成小气泡 同时 培养基中微生物发酵也会产生气体 从而在发酵液中形成大量气泡 培养 基中含有大量的发泡性糖 蛋白质和代谢物 极容易产生泡沫 这就会使发酵液 产生大量的泡沫 发酵罐中积存大量泡沫对发酵危害极大 因此 控制泡沫是保证正常发酵的 基本条件 而消除泡沫有许多方法 有消泡剂法消泡 机械消泡 由于现在使用 消泡剂无法确定其对发酵的影响 因此采用机械消泡法进行消泡 本设计采用在 发酵罐中安装消泡耙来达到机械消泡的目的 7 7 发酵计算发酵计算 7 17 1 发酵罐的结构发酵罐的结构 1 罐体 常为碳钢 2 搅拌器 分平叶式 弯叶式 箭叶式 其中平叶式功率最大 3 挡板 防止液面中央产生漩涡 促使发酵液激烈翻动 提高溶氧 一般为 4 6 片即可 高度通常为 3 4 倍罐体 挡板与罐壁间隙和挡板宽度相等 4 消泡器 分锯齿式 梳式 新式的有涡轮式 离心式 5 联轴器与轴承 6 变速装置 7 空气分布器 单管式 环形管式 中北大学课程设计说明书 第 18 页 共 26 页 8 冷却装置 9 入料孔 视灯 视镜 19 7 27 2 细胞色素细胞色素 C C 发酵通常采用机械搅拌通风发酵罐发酵通常采用机械搅拌通风发酵罐 7 2 17 2 1 常用的机械搅拌通风发酵罐几何比例常用的机械搅拌通风发酵罐几何比例 H D 1 7 3 5 HL D 2 2 5 d D 1 3 1 2 B d 0 8 1 0 W D 1 12 1 8 取 0 1 并留 1 2cm 间隙 以防死角 s d 2 1 5 2 5 2 表示搅拌器挡数 s d 3 1 2 1 5 d 2 可以取相同的值 HL 液位高度 D 发酵罐内径 H 筒身高度 W 挡板宽度 B 下搅拌 器距罐底的距离 s 搅拌器间距 d 搅拌器直径 发酵罐的大小用 公称体 积 V0表示 它指发酵罐的筒体体积 Va和底封头体积 Vb之和 V0 Va Vb 4 D2 H 0 15D3 7 2 27 2 2 工艺计算工艺计算 年产 5 吨 一年 250 个工作日 发酵周期为 72h 即 3 天 清理发酵罐 1 天 所生产的产品必须达到 GMP 规定 细胞色素 C 的产量为 0 77g L 发酵液收率为 95 预处理收率为 90 产品提取率为 56 精制得率为 95 产品纯度为 97 装 料系数为 80 则 总的提取率为 95 90 56 95 45 一年需放罐的次数 250 4 63 次 每批次产细胞素色 C 5000 64 79 4kg 发酵罐的体积为 V 79 4 45 0 77 0 8 97 295m3 取发酵罐的体积为 300m3 V0 Va Vb 4 D2 H 0 15D3 取 H D 2 则 H 2D 则 V0 4 D2 H 0 15D3 1 72D3 1 72D3 300m3 则 D 5 6m H 11 2m 中北大学课程设计说明书 第 19 页 共 26 页 B D 0 8 则 B 4 48 m W D 1 8 则 W 0 7m d D 0 5 则 d 2 8 m s d 1 5 则 s 4 2m 通过计算得到发酵罐各尺寸的理论值如表 7 1 表 7 1 发酵罐理论工艺尺寸 D m H m B m W m d m s m 5 6 11 2 4 48 0 7 2 8 4 2 7 2 37 2 3 物料衡算物料衡算 本次工艺设计采用一个 300m3的发酵罐 细胞色素 C 的周期生物量为 0 77g L 发酵液收率为 95 预处理收率为 90 产品提取率为 56 精制得率为 95 产品纯度为 97 装料系数为 80 发酵罐在一年的细胞色素 C 产量为 300 63 45 0 77 0 8 97 5081 2kg 故符合年产量 5 吨的生产要求 7 2 47 2 4 种子罐的设计种子罐的设计 本设计使用 300m3发酵罐 1 个 接种量为 10 种子罐装料系数为 80 由种 子罐到发酵罐的损失为 20 可算得种子罐中培养基总量为 300 80 10 80 30m3 故可采用一个 30m3 的一级种子罐 中北大学课程设计说明书 第 20 页 共 26 页 8 8 放罐及染菌防治放罐及染菌防治 8 18 1 发酵终点的判断发酵终点的判断 判断放罐的指标主要有菌体浓度 过滤速度 菌体形态 氨基氮 pH DO 和 发酵液的黏度和外观等 一般 菌丝自溶前的迹象有 氨基氮 DO 和 pH 开始上 升 菌丝碎片增多 黏度增加 过滤速度下降 由于此发酵产物为单细胞蛋白 所以要在菌体自溶前放罐 确切的说是稳定期 即菌体数量达到最大值后 所以 终点的判断十分重要 8 28 2 发酵染菌的防治与处理发酵染菌的防治与处理 在工业发酵中 染菌轻则影响产品的质和量 重则倒罐或停产 影响工厂效 益 因此要严格无菌操作 种子灭菌要彻底 净化空气设备 操作要慎重 设备 中北大学课程设计说明书 第 21 页 共 26 页 灭菌要彻底 若在前期染菌 应重新灭菌 中期染菌 应偏离杂菌生长条件 后 期染菌 可提前或及时放罐 可能出现的异常发酵现象 培养基变稀 可能是噬菌体污染或营养成分缺乏 培养基过浓 会抑制微生物的生长 考虑可能是污水污染 耗糖较慢 可能原因是种子生长能力降低 检测种子是否衰退 发酵条件 是否合适 以及营养成分是否全面 尤其注意缺磷 pH 值不正常 用缓冲对来调节 检查是否染杂菌 碳氮比是否合适 生长缓慢 最可能的原因就是营养成分不足 9 9 下游加工下游加工 下游加工过程是生物工程的一个组成部分 是生物化工产品通过微生物发酵 过程 酶反应过程或动植物细胞大量培养获得 以上述发酵 反应液或培养液分 离 精制有关产品的过程 下游加工过程的一般工艺流程为 发酵液 预处理 加热 调 PH 絮凝 细胞分离 过滤 离心 细胞破碎 匀浆 研磨 细胞碎片分离 离心 过滤 两水相萃取 初步纯化 沉淀 吸附 离子交换 萃取 高度 纯化 沉淀 色层分离 结晶 成品加工 浓缩 无 中北大学课程设计说明书 第 22 页 共 26 页 菌过滤 干燥 加工 本次细胞色素 C 的生产工艺流程为 9 19 1 发酵液的过滤和预处理发酵液的过滤和预处理 预处理就是除去高价离子和蛋白质 对高价离子的去除可以采用草酸或磷酸 草酸它与钙离子生成的草酸钙 还能促使蛋白质沉淀 加磷酸既能降低钙离子也 能降低镁离子 对于蛋白质的沉淀可以加入絮凝剂 调节 pH 值或加热 过滤 采 用鼓式真空过滤器 过滤前加去乳化剂并降温 9 29 2 细胞破碎细胞破碎 本次工艺利用超声波破碎细胞 超声波处理细胞悬浮液时 破碎作用受到许 多因素的影响 通常声强和振幅影响很大 但强度太高易使蛋白质变性 频率的 变化影响不明显 因此经超声波处理后 原先很粘稠的菌悬液 其流动性明显增 强 长细胞链断裂成短残链 细胞也部分破碎 具有一定的破壁效果 9 39 3 细胞色素细胞色素 C C 的提纯的提纯 本次纯化采用离子交换的方法进行提纯 具体方法为 取初步纯化的液体 通过 D132 型阳离子交换柱进行吸附 柱直径 2cm