三维重组人工皮肤模型在化妆品安全性评价中的应用分析

1 基金项目 国家自然科学基金项目 资助 三维重组人工皮肤模型在化妆品安全性评三维重组人工皮肤模型在化妆品安全性评 价中的应用价中的应用 孔雪 聂鹏举 何文丹 唐颖 中国化妆品创新协同中心 北京市植物资源研究开发重点实验室 北京工商大学理学院化妆品系 北京 摘要摘要 化妆品安全性评价是对化妆品进行从原料选用到准投放市场产品的潜在不良反应进 行定性和定量的毒理学评价 传统的化妆品安全性评价主要采用动物试验 随着科学技术 的发展和 3R 减少 替代和优化 原则的推动 三维重组人工皮肤模型因具有与人类皮肤 相似的生理结构和代谢功能而在的毒理学研究中获得了广泛的发展 本文主要综述了三维 重组人工皮肤模型在化妆品皮肤刺激 腐蚀性评价 眼刺激性评价 光毒性评价和遗传毒性 评价方面的应用现状 分析了皮肤模型的优缺点 并对其在化妆品安全性评价中的应用前 景以及发展策略提出了意见和建议 关键词 关键词 三维重组人工皮肤模型 化妆品安全 体外毒理学 动物替代方法 Safety Evaluation of Cosmetics based on In Vitro three dimensional reconstructed human epidermis 3D RHE models KONG Xue NIE Peng Ju HE Wen Dan TANG Ying China Cosmetic Collaborative Innovation Center Beijing Key Lab of Plant Resource Research and Development Department of cosmetics School of Science Beijing Technology and Business University Beijing China Abstract Cosmetics safety evaluation is employing a series of toxicological tests on both qualitative and quantative levels to assess the potential risks for the daily use of selected cosmetic ingredients and final products Traditional safety evaluation is mainly using animal tests With the development of in vitro science and 3Rs Reduction Replacement and Refinement principle three dimensional reconstructed human epidermis models have been developed and applied in cosmetic safety evaluation Reconstructed human skin models possess anatomy and metabolism biology similar to real human This paper reviews the current status of three dimensional reconstructed human epidermis models applied in skin irritation corrosion eye irritation photo toxicity and genotoxicity assessment of cosmetics The advantages and disadvantages of using skin models are also discussed with comments and suggestions for its future development Keywords three dimensional reconstructed human epidermis models cosmetic safety in vitro toxicity animal alternative methods 2 近年来化妆品行业问题频发 化妆品的安全性日益受到企业和消费者的关注 化妆品 的安全性评价是对化妆品潜在不良作用进行定性和定量的认定和评价 目的在于降低化妆 品不良作用 预测化妆品的远期效应以及制订安全接触限值 1 传统的安全性评价主要采 用动物模型进行 然而 动物试验存在评价周期较长 重复性差 精确度低等缺点 而且 动物与人具有种间的生理与敏感性差异 因此动物试验结果在外推到人类时具有不确定性 同时 根据欧盟化妆品规程第7次修正案 2003 15 EC 2003 规定 2 2013年起欧盟已全面 禁止动物实验 不再允许成员国进口和销售曾进行过动物试验的化妆品原料和成品 因此 以三维重组人工皮肤模型等为代表 采用人工培养的组织或细胞等非生命系统的体外试验 因具有试验周期短 实验条件可控和结果易于定量等优点而日益受到企业和科研机构的重 视 1 三维重组人工皮肤模型 三维重组人工皮肤模型 3D RHE model 是目前在化妆品体外安全性评价中的研究热 点 皮肤模型是将人的正常皮肤细胞培养于特殊的插入式培养皿上而得到的具有高度模拟 人体皮肤 具有完整三维解剖结构的皮肤组织模型 3 皮肤模型的表面具有由人表皮角质 细胞分化形成的角质层 与单层细胞培养物相比 对化妆品受试物的溶解性限制少 未经 稀释 极端pH和 不可溶的 测试材料均可直接用于皮肤模型 同时能够根据人体所接触光 的强度 时间以及波长范围进行光接触试验 此外 由于大部分皮肤模型由人的初代细胞 组成 因此可以避免因种间差异而带来的试验结果偏差 4 现已验证的皮肤模型在基因表 达 组织结构 细胞因子 组织活力等方面与人体皮肤都具有高度一致性 5 皮肤模型的 研发之初主要用于临床上大面积皮肤损伤与缺失的修复 美国于70年代成功构建了的由上 表皮细胞组成的表皮模型 成为皮肤模型发展的一个里程碑 皮肤模型于90年代开始应用 于化妆品的体外评价 6 经过二三十年的发展 各种皮肤模型 见表1 目前广泛应用于 化妆品安全性评价中的皮肤刺激 腐蚀性 7 眼刺激性 8 光毒性 9 遗传毒性 10 和致敏性 5 等 不同类型的化妆品安全性评价 所使用的皮肤模型及其检测指标也有一定差异 表2 3 4 表表 1 商品化的三维重组人工皮肤模型商品化的三维重组人工皮肤模型 名称名称制造商制造商国家国家模型特征模型特征 EpiSkinTM欧莱雅法国 以乳房整形手术去除皮肤组织的表皮角质形成细胞为种子细胞 采用胶原介质培养而成的表皮重建模型 EpiSkinTM欧莱雅中国 以中国成年人阴茎包皮组织的表皮角质形成细胞为种子细胞 采 用胶原介质培养而成的表皮重建模型 EpiDermTMMatTek美国 以包皮组织的表皮角质形成细胞为种子细胞 采用无血清培养基 培养而成的表皮重建模型 SkinEthicTM欧莱雅法国 以包皮组织的表皮角质形成细胞为种子细胞 采用惰性聚碳酸酯 酶介质培养而成的表皮重建模型 EpiKutisTM 陕西博溪生物 科技有限公司 中国 以儿童包皮组织的表皮角质形成细胞为种子细胞 采用无血清培 养基 液下培养后气液面培养而成的表皮重建模型 EpiOcularTMMatTek美国 以正常人新生包皮上皮组织的细胞为种子细胞 采用无血清 DMEM 培养基 EGF 胰岛素 HYD 等 的气液面培养方式培 养而成的无角质层的角膜上皮模型 EpiCornealTMMatTek美国 以正常人角膜上皮组织的细胞为种子细胞 采用无血清培养基的 气液面培养方式培养而成的无角质层的角膜上皮模型 HCESkinEthic法国 以永生化人角膜上皮组织的细胞为种子细胞 采用气液面培养方 式培养而成的无角质层的角膜上皮模型 FP 3D 北京富龙康泰 生物技术有限 公司 中国全层皮肤模型 Strata TestStratatech美国使用人体角质细胞系和 NIKS 形成的全层皮肤模型 Phenion FTHenkel德国 新生儿包皮原代角质细胞培养于胶原支架成纤维细胞 形成结缔 组织作为多层上皮细胞层的基础 Graftskin LSEOrganogenesis美国 以表皮角质细胞为种子细胞 采用气液面培养方式培养于包含胶 原质的成纤维细胞中 LabCyteTM EPI MODEL Japan Tissue Engineering 日本 来自新生儿包皮的角质细胞和 3T3 J2 在惰性过滤器基质中生长 采用气液面方式培养 表表 2 化妆品安全性评价种类及其皮肤模型及检测指标化妆品安全性评价种类及其皮肤模型及检测指标 化妆品安全性评价化妆品安全性评价适用皮肤模型适用皮肤模型检测指标检测指标 皮肤刺激性 EpiDerm 7 14 SkinEthic 14 Episkin LabCyte EPI Model 14 皮肤刺激性检测 SIT ET50 值和细胞因 子 IL 10 IL 1 TNF 11 15 的释放量 眼刺激性EpiOcular 8 EpiOcularTM眼刺激试验 EIT 17 光毒性 EpiSkinTM 28 EpiKutis 29 EpiDerm 9 30 SkinEthic 31 MTT 法检测细胞活率 细胞因子 IL 1 IL 1 和 IL 6 26 27 的释放量 遗传毒性EpiDerm 35 36 皮肤模型微核试验和皮肤模型彗星试验 5 本文现就皮肤模型在化妆品皮肤刺激性 眼刺激性 光毒性和遗传毒性中的应用综述如下 2 皮肤模型在化妆品安全性评价中的应用 皮肤刺激性 眼刺激性 光毒性和遗传毒性是化妆品安全性评价中的重要检测项目 在我国 皮肤和眼睛刺激和光毒性试验主要使用动物模型 如兔 豚鼠 12 但残忍性和 缺乏科学的准确性使其被欧盟和美国禁止使用 以眼刺激为例 由于兔眼无泪腺 在大多 数情况下实验数据会过度预测人体反应 采用细胞培养和微生物研究遗传毒性具有良好的 灵敏度 但实验的精度较低 对样品的溶解度也有限制 相比之下 皮肤模型模型与人体 皮肤具有很好的相似性 试验精度高 灵敏度高 重现性好 因此被越来越多地应用在以 上化妆品安全性评价 目前多种皮肤模型结合不同毒理学靶位点可被运用于这些领域 表2 2 1 皮肤刺激性 皮肤刺激性是指皮肤接触受试物后产生的局部可逆性损伤 13 目前皮肤刺激性的体外 评价方法有细胞法 离体皮肤组织法和皮肤模型法 由于皮肤毒性作用的复杂性 采用细 胞法虽然标准化程度高 成本低 但由于单层细胞的结构简单 不具备屏障功能 实验结 果有时会过高预测毒性作用 离体皮肤组织法主要采用尸体或美容外科手术获取的皮肤 皮肤来源不稳定且价格高昂 从20世纪90年代开始 三维重组人工皮肤模型成为评价化妆 品皮肤刺激性的理想模型 现经ECVAM验证可用于皮肤刺激性评价的皮肤模型有 EpiSkinTM EpiDermTM和EpiEthicTM三种 目前 皮肤模型体外刺激性评价主要包括皮肤刺激性单点试验 Skin Irritation Test SIT 14 和时间毒性 Time to Toxicity 试验 15 根据OECD TG 439指南 14 SIT试 验以固定时间将皮肤模型暴露于化妆品原料 以MTT试验根据皮肤表面组织活力的降低程 度 50 为阈值 可将受试物区分为刺激性 I 和非刺激性 NI 而对于部分温和的化妆 品 需要延长受试物在模型表面的停留时间 按照不同时间点进行暴露 以时间毒性 ET50 进一步区分轻度至极轻度的刺激性 15 因此时间 毒性试验特别适用于对化妆品 原料或配方与时间相关的刺激性进行比较 ET50越小 表示模型对化妆品的耐受时间越短 则化妆品的时间毒性越强 在皮肤刺激性的发生过程中 角质形成细胞细胞会释放出炎性 细胞因子 如IL 1 IL 6 IL 8 IL TNF 这些细胞因子的释放 尤其是IL 1 可以 作为MTT试验的重要补充 11 15 Kand rov 7 等使用 EpiDerm SIT 验证了皮肤模型在皮肤刺激试验中的可行性 可以区 分刺激性的有无 但试验发现一些受试物可能受 MTT 干扰 Spiekstra 等还试图用皮肤模 型根据 EC50 值来决定化妆品的皮肤刺激效价 而非对刺激性与非刺激性的简单区分 16 总之 使用皮肤模型评价化妆品的皮肤刺激性 操作简单快速 评价指标直观 不仅可以 区分刺激性的有无 还可以进一步区分刺激性的强弱和时间毒性 2 2 眼刺激性 眼刺激性是指受试物作用于眼睛后在 21 天内产生的可逆性变化 17 目前通过 ECVAM 验证的眼刺激性评价方法主要有 1 离体器官试验 牛角膜浑浊及通透试验 BCOP 18 和 隔离鸡眼试验 ICE 19 2 基于细胞毒性和细胞屏障功能的试验 微生理计 CM 20 和荧 光素渗漏试验方法 FL 21 3 EpiOcularTM眼刺激试验 EIT 17 目前单一试验并不能完 6 全替代兔眼试验 因此在评价眼刺激时常采用分级策略将结合多种体外试验方法进行评价 评价眼刺激性时使用的三维重组角膜上皮模型 3D RhCE 无角质层 使其与普通模型 相比具有更高的灵敏度 22 根据 OECD TG 492 指南 17 测试时采用正常人新生包皮上皮 细胞体外重建类人角膜上皮模型 EpiOcularTM 用 MTT 法检测化妆品作用后的模型细胞活 性 相对于阴性对照组织 活性低于 60 时化妆品被判断为具有眼刺激性 活性高于 60 时化妆品被认为是无刺激性 Kaluzhny 等人 9 报道了利用 EpiOcularTM进行眼刺激性试验 Eye Irritation Test 验证 了模型的整体精确度为 88 灵敏度和特异性分别达到了 100 和 75 2013 年 欧洲化 妆品 Cosmetic Europe formerly COLIPA 报道了实验室间基于两种重建角膜上皮模型 Human Corneal Epithelium HCE EpiOcula 23 和 SkinEthic 在眼刺激性试验中具有 良好的的重复性 24 陕西博溪生物科技有限公司也使用以中国眼角膜上皮细胞为种子细胞 的的角膜上皮模型对化学标准品进行了检测 结果与兔眼刺激一致 表明皮肤模型可用于 体外眼刺激性检测 2 3 光毒性 光毒性是指皮肤一次接触光敏性化学物质后暴露于紫外线照射下所引发的局部或全身 的非免疫性毒性反应 25 其临床特征为出现晒斑 水疱等皮肤问题 26 现有的光毒性体外 评价方法主要包括 3T3 成纤维细胞中性红摄取光毒性试验 3T3 NRU PT 联合血红细 胞光毒性试验 RBC PT 和皮肤模型试验 3T3 NRU PT 试验是唯一通过正式验证 OECD 432 25 的体外方法 但试验有一定的不足 1 测试使用细胞活力作为唯一的终点 仅可 检测急性毒性 2 无法分析毒性作用机制 3 测试显示高频率的阳性结果 最早将三维皮肤模型应用于光毒性试验是在 1994 1995 年间 主要采用了全层皮肤模 型和表皮模型 使用表皮模型进行光毒性检测 实验时先将受检物滴加于模型表面 然后暴 露于一定辐照剂量 通常为 1 7 mW cm2 的紫外线下一个小时 再使用 MTT 法检测模型的 细胞活率 26 使用全层模型进行光毒性检测时 一般检测细胞存活率和细胞因子 IL 1 IL 1 和 IL 6 的释放量 27 目前 皮肤模型在化妆品光毒性评价中的应用十分广泛 J rova 等 9 用皮肤模型对沥 青焦油中的两种成分 鱼石脂和磺化页岩油 进行光毒性效应评估 结果表明皮肤模型能 更好的反映了皮肤对化学物质的生物利用度 与人体数据的相关性较好 有研究基于 EpiSkinTM确定化学品的局部或全身光毒性效力 结果敏感度 92 3 特异性 100 总体 精确度达 94 1 28 卢永波等 29 成功构建了中国汉族人体外皮肤模型 EpiKutisTM 用作为紫 外损伤研究 研究结果表明 EpiKutisTM可发展为皮肤光毒性的测试模型 韩国的 Park 等 30 用 皮肤模型来检测聚苯乙烯与二氧化钛纳米粒子的光毒性 首次使用了皮肤模型来评估纳米 粒子的光毒性 并通过比较发现皮肤模型是检测纳米材料光毒性的理想模型 Bernard 等 31 通 过试验发现 SkinEthicTM人工重组皮肤模型在辐照强度 6J cm2时可以很好地预测化学物质 潜在的光毒性 包括低光毒性成分和使用高剂量的 UV 18 J cm2 2 4 遗传毒性 遗传毒性描述了化学物质在细胞内破坏遗传信息造成突变的特性 目前的体外评价主 要通过三个基因端点来评估遗传毒性 1 基因水平上的突变 2 染色体断裂或重新排 列 3 异常染色体数目 32 常用的体外试验包括 1 可逆细菌诱变试验或 Ames 试验 7 2 体外微核试验 3 体外哺乳动物细胞诱变试验 小鼠淋巴瘤试验和次黄嘌呤 鸟嘌 呤磷酸核糖激转移酶试验 4 哺乳动物体外染色体突变试验 33 这些方法具有良好的敏 感性 但是特异性较低 可能导致假阳性结果 目前 皮肤模型用于遗传毒性评价的主要有皮肤模型微核试验和皮肤模型彗星试验 34 在皮肤模型试验中 受试的化妆品成分因暴露条件更接近真实的曝光条件使得皮肤模型具 有更好的预测性能 Mun 等人 35 36 利用 EpiDermTM皮肤模型进行微核试验 测试表明 三 维人体模型可以评价类似于体内评价的染色体损伤 是一种很有前途的新型体外遗传毒性 试验工具 Reus 10 使用彗星电泳法在 EpiDermTM 和EPI 200 MNA 皮肤模型上测试了 5 种 编码组分 MMS N ethyl Nnitrosourea 2 4 diaminotoluene cyclohexanone p nitrophenol 通过受损 DNA 所占比例来评价化学物质的遗传毒性 结果表明基于 EpiDermTM皮肤模型 彗星电泳法对于暴露于真皮的化学组分的遗传毒性评价具有良好的预测性 3 小结 综上所述 利用三维重组皮肤模型在进行化妆品安全性评价时具有以下优点 1 与人体皮肤高度类似 不同理化性质的化学物质 疏水或固体化学物质 复杂混合物或配 方 均可应用于皮肤模型 此外 高浓度 与体内使用的浓度相近 的物质也可以直接用 于组织表面 2 实验条件精确可控 实验中的可变因素减少 实验数据具有较好的重复性 3 试验周期短 相对于动物模型和临床试验的费用减少 4 实验样品的需求量减少 5 有效的减少了实验动物的使用 在具有诸多优点的同时 目前生产的皮肤模型仍存在一些问题 1 人工培育的皮 肤模型缺乏毛囊 汗腺和皮脂腺等皮肤附属结构 2 作为单一的组织模型 无法测试组织 和其它器官 生物系统的相互作用 3 不能检测受试物的慢性毒性作用 4 皮肤模型屏 障功能不如真人皮肤 通透性过大 无法准确测试受试物的经皮吸收率 5 在我国皮肤模 型的供应商有限 价格较高等 皮肤模型法未来可能的发展应包括进一步提供政府要求的 验证数据以获得全球认可 延长皮肤模型作为体外模型的暴露时间以进一步进行慢性暴露 的毒理学研究等 8 9 参考文献参考文献 1 马来记 魏少敏 化妆品安全评价进展 C 2004 年中国化妆品学术研讨会 2004 8 12 2 Pauwels M Rogiers V Safety evaluation of cosmetics in the EU reality and challenges for the toxicologist J Toxicology letters 2004 151 1 7 17 3 张春晓 杜镇建 张兴民 等 3D 人造皮肤模型在化妆品安全性 功效性评价中的应用 J 中国化妆 品 2014 2 38 40 4 Gordon S Daneshian M Bouwstra J etc Non animal models of epithelial barriers skin intestine and lung in research industrial applications and regulatory toxicology J Alternatives to Animal Experimentation 2015 32 4 327 378 5 程树军 焦红 实验动物替代方法原理与应用 M 北京 科学出版社 2010 188 340 6 安子扬 皮肤模型的构建及在检测药物化妆品中的应用 D 河北农业大学硕士论文 2013 7 Kand rov H Hayden P Klausner M etc An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model J Electrophoresis 2009 29 1366 8 Kaluzhny Y Kand rov H Hayden P etc Development of the EpiOcular Eye Irritation Test EpiOcular EIT for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the cosmetics directive and REACH legislation J Alternatives to laboratory animals 2015 43 2 101 127 9 J rov D Kejlov K Bendov H etc Phototoxicity of bituminous tars correspondence between results of 3T3 NRU PT 3D skin model and experimental human data J Toxicology in Vitro 2005 19 7 931 934 10 Reus AA Reisinger K Downs TR etc Comet assay in reconstructed 3D human epidermal skin models investigation of intra and inter laboratory reproducibility with coded chemicals J Mutagenesis 2013 28 6 709 720 11 Bernhofer LP Seiberg M Martin KM The influence of the Response of skin equivalents systems to topically applied consumer Products by epithelial mesenchymal interaction J Toxicology in Vitro 1999 13 219 229 12 中华人民共和国卫生部 化妆品安全技术规范 S 2015 13 Test No 404 Acute Dermal Irritation Corrosion S OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 2010 1 4 1 13 14 Test No 439 In Vitro Skin Irritation Reconstructed Human Epidermis Test Method S OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 2010 1 4 1 18 15 Costin GE Raabe H Curren R In Vitro Safety Testing Strategy for Skin Irritation Using The 3D Reconstructed Human Epidermis J Romanian Journal of Biochemistry 2009 46 2 165 186 16 Spiekstra SW Dos Santos GG Scheper RJ etc Potential method to determine irritant potency in vitro Comparison of two reconstructed epidermal culture models with different barrier competency J Toxicology In 10 vitro 2009 23 2 349 355 17 Test No 492 Reconstructed human Cornea like Epithelium RhCE test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage J OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 2015 1 27 18 Test No 437 Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants S OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 2010 1 4 1 18 19 Test No 438 Isolated Chicken Eye Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants S OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 2010 1 1 18 20 European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing EUAL ECVAM Validation 23 2 3 73 80 28 Leli vre D Justine P Christiaens F etc The EpiSkin phototoxicity assay EPA development of an in vitro tiered strategy using 17 reference chemicals to predict phototoxic potency J Toxicology In vitro 2007 21 6 977 995 29 卢永波 张荣芳 许珊珊 等 一种用于体外测试的中国汉族人表皮替代模型 J 中国药理学与毒理 学杂志 2013 27 S1 310 310 30 Park YH Jeong SH Yi SM etc Analysis for the potential of polystyrene and TiO2 nanoparticles to induce skin irritation phototoxicity and sensitization J Tox