143、糖化酶菌种岗位标准操作规程

生产标准操作和管理程序生产标准操作和管理程序起草 起草 日期 日期 标准操作程序标准操作程序 过程控制程序 过程控制程序审核 审核 日期 日期 糖糖化化酶酶菌菌种种岗岗位位标标准准操操作作规规程程批准 批准 日期 日期 SOP IPC 143 00 执行日期 执行日期 签名 签名 变更记载 变更记载 修修 订订 号号 批批 准准 日日 期期 执执 行行 日日 期期 变更原因及目的 变更原因及目的 发放部门 生产部发放部门 生产部 品质管理部品质管理部 发酵车间发酵车间 SOPSOP IPCIPC 143143 0000 第第 2 2 页共页共 8 8 页页 1 目的 建立糖化酶生产种子岗位操作规程 使种子工严格操作 确保种子质量及 无菌 2 适用范围 适用于种子岗位 3 责 任 者 种子操作人员 4 正 文 1 菌种工艺流程 甘油管 淀粉平板 半干体 种子摇瓶 种子罐 原始菌种先接入淀粉平板 半干体纯化后由半干体接入甘油管 2 培养基制备 2 1 甘油管制备 在 50 或 100ml 三角瓶中配置 50 浓度的甘油乳液 121 0 11Mpa40 分钟灭菌 2 次 放无菌室备用 备用期不能超过 10 天 如果已经使用过 在下次使用时仍需 灭菌 用玻璃小试管 10 100 或塑料小试管洗净烘干 121 0 11Mpa40 分钟灭 菌 2 次后备用 糖化酶用半干体做甘油管 即在无菌条件下吸取 1 2ml 半干体于小 试管内 同时吸取等量备用 50 的甘油于小试管中 塞好胶塞 充分摇匀 此时的甘 油浓度为 20 或略高 如果浓度太高不能冷凝 太低细胞容易破碎不能保藏 一般情 况放入 80 冰箱保藏半年或一年 时间不能太长 2 2 淀粉平板的制备 淀粉培养基 淀粉平板 蛋白胨 1 0 酵母粉 0 2 牛肉粉 0 3 NaCL 0 2 玉米淀粉 1 0 琼脂粉 1 7 称量完毕后定容到所需体积 用稀盐酸调 PH 到 5 8 6 1 煮沸使琼脂溶解 121 30 分钟灭菌 冷却到 50 倒平板 每皿 20 25ml 分离时用移液管吸取 0 1ml 0 2ml 半干体种子涂布于培养基中 33 1 培养 4 5 天 技术要求 单菌落 要多 呈褶皱 盆地状 2 3 察氏平板的制备 蔗糖 3 硝酸钠 0 2 磷酸氢二钾 0 1 MgSO47H2O 0 05 FeSO47H2O 0 001 KCL 0 05 琼脂粉 1 7 SOPSOP IPCIPC 143143 0000 第第 3 3 页共页共 8 8 页页 称量完毕后定容到所需体积 用稀盐酸调 PH 到 5 8 6 1 煮沸使琼脂溶解 121 30 分钟灭菌 冷却到 50 倒平板 每皿 18 20ml 将淀粉平板中典型菌落涂 布于培养基中 33 1 培养 4 5 天 技术要求 菌苔厚 无杂菌污染 灰色带红 2 4 半干体培养基 蔗糖 3 硝酸钠 0 2 磷酸氢二钾 0 1 MgSO4 7H2O 0 05 FeSO4 7H2O 0 001 KCL 0 05 琼脂粉 0 05 称量完毕后定容到所需体积 用稀盐酸调 PH 到 5 8 6 1 煮沸使琼脂溶解 121 30 分钟灭菌 将察氏平板中典型菌苔刮入培养基中 34 培养 4 5 天 培养 期间每天每 6 小时顺时针摇 3 4 圈 2 5 种子摇瓶制备 豆饼粉 2 玉米浆 2 玉米淀粉 12 高淀 0 05 豆粉单独称量倒入瓶中 玉米淀粉加热煮沸液化 10 分钟 每瓶装量 150ml 500ml 121 40 分钟灭菌 将半干体在无菌条件下吸入 10 15ml 上摇床 转 速 300 转 分钟 33 34 培养 2 3 天 3 火焰保护法接种小罐 3 1 准备工作 酒精棉球一瓶 镊子 火柴 喷雾器 3 2 小罐接种 罐温降至 32 时 用 75 酒精棉球消毒接种口及用 5 石碳酸喷雾 消毒小罐周围的空气 然后在小罐接种口点燃酒精棉灭菌 关闭接种葫芦靠罐阀 拧 开接种帽 不要将其拿出火焰保护范围 将装有种液的摇瓶在火焰保护下迅速倒入接 种葫芦内 拧上接种帽 打开靠罐阀 调整罐压使之升到 0 08MPa 再缓慢降至 0 03MPa 反复数次 利用压差法将种液接入罐内 4 无菌试验 4 1 固体 液体细菌培养基的制备方法 原料名称固体配方 液体配方 SOPSOP IPCIPC 143143 0000 第第 4 4 页共页共 8 8 页页 葡萄糖 0 3 牛肉膏 0 50 3 蛋白胨 0 61 0 氯化钠 0 50 5 酚 红 0 4 琼 脂 2 0 2 2 PH 7 0 7 27 0 7 2 4 2 固体培养基的配制 4 2 1 称取牛肉膏 蛋白胨于烧杯中 加适量水 加热搅匀溶解后加至需要量水 然后用 10 NaOH 调节 PH 值 用 PH 计测定 4 2 2 将调好 PH 值的固体培养基分装在三角瓶中 1000ml 瓶装量 200ml 加琼脂 包扎好消毒 压力为 0 10 0 11MPa 温度 121 1 时间 30 分钟 4 2 3 消毒后的固体培养基自然冷却至 50 左右在无菌条件下倒碟 每支双碟装 量 20 25 ml 不易太厚或太薄 凝固移入恒温室培养 24 48 小时 检查无菌方可 使用 5 取无菌样 5 1 种子罐每隔 8 小时取无菌样一次 划无菌平板 2 个 大罐每 8 小时取一次 划无菌平板 2 个 补料罐每 4 小时取无菌样一次 划无菌平板 2 个 5 2 用 75 酒精棉擦净取样试管壁外沿的发酵液 置 36 37 恒温室培养 5 3 取无菌样注意事项 5 3 1 取无菌样时要提前半小时开蒸汽消毒取样管路 15 分钟 蒸汽压力在 0 2MPa 以上 5 3 2 取无菌样要求稳 准 快 取少许培养液入无菌试管内 5 3 3 取消后样时 放净取样管路冷凝水 温度低于 33 方可取样 取其它无菌 样先让发酵液流一会再取 5 3 4 取无菌样时 关闭窗户 不让周围空气流动 5 3 5 取样不能使棉塞沾湿 6 无菌样品的检查和异常情况的分析判断 6 1 每班需要及时检查无菌样 3 4 次 并做好记录 交接班时应交接无菌反映 情况 有异常情况及时与车间工艺员 消毒有关人员联系 SOPSOP IPCIPC 143143 0000 第第 5 5 页共页共 8 8 页页 6 2 如果发现无菌平板菌落生长有异常现象 需及时进行镜检 6 3 连续 2 个时间样品有杂菌落生长 镜检同一菌型 或者实样镜检确定发现 杂菌 误差样除外 可判断该罐染菌 出染菌通知单 必要时 4 小时加放 及时出 染菌通知 6 4 种子罐无菌样品进大罐 24 小时方可处理 大罐无菌样保留当班前 4 个样品 此前样品可以处理 7 涂片 无菌检测 火 焰 火 焰 涂片步骤 涂片 干燥固定 染色 水洗 干燥固定 观察 用肥皂水洗净载玻片 浸泡在 75 酒精中备用 用接种针蘸少量发酵液涂在载 玻片上 用蒸镏水稀释用酒精灯火焰干燥 用结晶紫染色一分钟后用水冲净晾干或 酒精灯烤干固定 片上滴一滴香柏油 以油镜观察 7 1 涂片镜检后应保留一天后处理 浸泡在来苏儿溶液中 载玻片清洗时将浸 泡在来苏儿溶液里的载玻片取出先用开水冲洗片刻 放入适量洗衣粉 并浸泡片刻 即可用清水冲洗直至漂清 再用干净的软布拭干备用 8 菌体形态涂片镜检 将接种针在酒精灯火焰上烧红后拭冷 挑取肉眼可见的菌球 发酵液可不用挑菌 球 直接取料液涂 一个或几个于干净载玻片上 滴一滴棉兰染液 盖上盖玻片 加盖时注意尽量使片上没有小气泡 用 40X16 显微镜观察 9 种子罐移种的鉴定 9 1 种子罐移种前 1 小时认真镜检全部无菌样 有无染菌 对无菌情况作出正 确判断 9 2 要根据生化结果 PH 菌体形态 还原糖 外观等检查种子生长代谢是否正 常 9 3 如断定种子无菌且生长正常可通知消毒者移种 移种通知在 2 小时内有效 若因故推迟 需重新镜检样品 降温或加温 9 4 要严格控制种子罐移种标准 如果种子生长速度过快 过慢或大罐因故拖延 进度应及时采取相应措施 9 5 种子罐移种标准 9 5 1 一级种子 9 5 2 培养时间 55 75h 酶活力在 800 1000u ml PH 呈下降趋势 SOPSOP IPCIPC 143143 0000 第第 6 6 页共页共 8 8 页页 9 5 3 镜检及平皿无凝点 菌球典型 轮廓粗壮 以镜检通知单及平皿检验合 格为准 9 6 二级种子 9 6 1 培养时间 40 50h 酶活力在 8000 10000u ml PH4 5 4 8 9 6 2 还原糖值在 50 以上 9 6 3 镜检无疑点 菌球典型 粗壮 平皿检验合格 1010 常用试剂的配制常用试剂的配制 10 1 5 石碳酸 苯酚 5g 加水 自来水 至 100ml 10 2 2 的来苏尔 50 的来苏儿 40ml 加自来水至 1000ml 10 3 75 的酒精 95 酒精 79ml 加自来水 21ml 10 4 10 KOH KOH 10g 加蒸馏水至 100ml 10 5 0 3 美兰染色液 称取美兰 3g 溶于 95 酒精 100ml 中 即成饱和原液放置 24 小时 加蒸馏水制 1000mL 容量瓶中摇匀备用 10 6 过氧乙酸混和液 过氧乙酸和过氧乙酸 和过氧乙酸 等量混和放置 24 小时 以后再用 10 7 1 酚红 1g 溶于酒精中用水稀释至 100ml 10 8 0 25 新洁尔灭 5 原液 100ml 加水至 2000ml 10 9 洗涤液 重铬酸钾 15g 加浓硫酸 200ml 加热半小时用玻璃丝过滤 SOPSOP IPCIPC 143143 0000 第第 7 7 页共页共 8 8 页页 革革兰兰氏氏 Gram 染染色色液液 1 草酸铵结晶紫染液 A 液 结晶紫 crystal violet 2g 95 酒精 20ml B 液 草酸铵 ammonium oxalate 0 8g 蒸馏水 80ml 混合 A B 二液 静置 48 小时后使用 2 卢戈氏 Lugol 碘液 碘片 1 0g 碘化钾 2 0g 蒸馏水 300ml 先将碘化钾溶解在少量水中 再将碘片溶解在碘化钾溶液中 待碘全溶后 加足 水分即成 3 95 的酒精溶液 4 番红复染液 番红 safranine O 2 5g 95 酒精 100ml 取上述配好的番红酒精溶液 10ml 与 80ml 蒸馏水混匀即成 乳乳酸酸石石炭炭酸酸棉棉蓝蓝染染色色液液 石炭酸 10g 乳酸 比重 1 21 10ml 甘油 20ml 蒸馏水 10ml 棉蓝 cottonblue 0 02g 将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解 然后加入乳酸和甘油 最后加入棉蓝 使其溶 解即成 本岗包括记录有 摇瓶配制记录 SZ FJ M1030 00 摇瓶培养记录 SZ FJ M1031 00 淀粉平板观察记录 SZ FJ M1032 00 察氏平板观察记录 SZ FJ M1033 01 冰箱温度记录 SZ FJ M1034 00 超净台菌落数测定 SZ FJ M1035 00 察氏平板贮存使用记录 SZ FJ M1036 00 SOPSOP IPCIPC 143143 0000 第第 8 8 页共页共 8 8 页页 微生物鉴定培养基记录 SZ FJ M1037 00 无菌室消毒记录 SZ FJ M1038 00 摇瓶种子分析记录 SZ FJ M1039 00 半干体观察记录 SZ FJ M1040 00 半干体配制记录 SZ FJ M1041 00 半干体贮存使用记录 SZ FJ M1042 00 恒