大肠杆菌菌种的制作及保藏

1 大肠杆菌菌种的制作及保藏大肠杆菌菌种的制作及保藏 谢雪芳 一 实验原理一 实验原理 1 1 分离原理 分离原理 用伊红美蓝培养基检测大肠杆菌 伊红为酸性染料 美蓝为碱性染料 当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成 红色 再与美蓝结合形成紫黑色菌落 并带有金属光泽 从菌落表 面的反射光中还可以看到金属光泽 从而可从众多的菌落中把大肠 杆菌选择出来 2 2 保存原理 保存原理 将大肠杆菌接种到固体培养基中放入较低的温度 4 的冰箱中进行保藏 可保存 3 到 6 个月 用来给学生做实验很方 便 二 实验材料二 实验材料 1 1 实验试剂 实验试剂 牛肉膏 2 5g 蛋白胨 5g 氯化钠 2 5g 琼脂 10g 乳糖 10g 蒸馏水 500 ml 2 伊红水溶液 10ml 0 5 美蓝水溶液 5ml 1mol l 的 NaOH 1mol l 的 HCL 2 2 实验器材 实验器材 酒精灯 高压蒸气灭菌锅 培养皿 涂布器 锥形 瓶 100ml 烧杯 500ml 烧杯 100ml 锥形瓶 500ml 锥形瓶 试管 无菌操作台 恒温培养箱 三 实验步骤 三 实验步骤 一 制备培养基 一 制备培养基 2 1 1 培养基配制 培养基配制 1 1 伊红美蓝培养基 伊红美蓝培养基 称量称量 蛋白胨 5g 氯化钠 2 5g 琼脂 10g 溶化溶化 往烧杯中加入称量好的蛋白胨 氯化钠 用玻棒搅拌 使其溶解 加入琼脂 加热使其溶化 溶解后用蒸馏水定容至 500 ml 调节 pH 值为 7 6 灭菌灭菌 将配制好的培养基转移到锥形瓶中 加棉塞 包上牛皮 纸 并用皮筋扎紧 再连同培养皿等一起放入高压灭菌锅 在压力 为 100KPa 温度为 121 条件下 灭菌 15 到 30 分钟 倒平板倒平板 冷却至 60 左右 再按基础培养基 100 ml 20 乳糖 2ml 2 伊红水溶液 2ml 0 5 美蓝水溶液 1ml 的比例 在无菌 操作条件下加入灭菌的乳糖溶液 伊红水溶液及美蓝水溶液 摇匀 后 立即倒平板 溶液中的乳糖高温下会破坏 因此一般使用压力 为 70KPa 温度为 115 的条件灭菌 20min 2 2 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 2 5g 蛋白胨 5g 氯化钠 2 5g 琼脂 10g 将上述物质溶解后 用蒸馏水定容到 500ml 二 分离纯化大肠杆菌 二 分离纯化大肠杆菌 1 1 平板划线分离法 平板划线分离法 用接种环蘸下水道溶液或土壤浸出液 后在含有固体培养基的培养皿平板上划线 在划线过程中菌液逐 渐减少 细菌也逐渐减少 划线到最后 可使细菌间的距离加大 在培养 10 20h 后 可由一个细菌产生单菌落 菌落不会重叠 如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上 在 3 斜面上划线 则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代 划 线完毕后 盖上皿盖 倒置于恒温箱培养 取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物 除第一 次划线外 其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留 菌种 取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行 其目的是防止高 温杀死菌种 最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者 2 2 稀释涂布分离法 稀释涂布分离法 先将水道溶液或土壤浸出液稀释 通常稀 释到 104 106之间 然后取 0 1ml 不同稀释度的稀释菌液放在培养 皿的固体培养基上 用玻璃器涂布在培养基平面上进行培养 在适 当的稀释度下 可产生相互分开的菌落 通常每个培养皿有 20 个以 内的单菌落最为适合 将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后 再做功能性实验 划线分离法 方法简单 涂布分离法 单菌落更易分开 但操 作复杂些 细菌的两种分离法各有优点 都可采用 三 菌落培养 三 菌落培养 将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入 37 的恒温箱中培养 培养 12h 和 24h 后 培养基中会出现大肠杆 菌菌落 菌落中心呈暗蓝黑色 发金属光泽 分别观察并记录结果