荧光分析法测定VB2

荧光分析法测定荧光分析法测定 VBVB2 2 2 2 学时 学时 一 实验目的 一 实验目的 1 了解荧光分光光度计的基本原理 仪器结构和使用方法 2 学习和掌握荧光光度分析法测定 VB2的基本原理和方法 二 实验原理二 实验原理 当物质的分子接受光子能量被激发后 从激发单重态的最低振动能级返回 基态时发射光子的过程 称之为荧光 荧光分析中包括激发光谱和发射光谱 是荧光物质的两个重要的性能指标 激发光谱是荧光物质在不同波长的激发光 作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况 荧光光谱则是某一固定波长 的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况 利用物质被光照射后产生 的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法 称为荧光分析法 对很稀的溶液 荧光强度 F 与该物质的浓度 c 有以下的关系 F K c 式中 K 为常数 因此 在低浓度的情况下 荧光物质的荧光强度与浓 度呈线性关系 VB2 即核黄素 在 430 450 nm 光的照射下发出荧光 其峰值波长为 530 nm 左右 VB2的荧光在 pH 6 7 时最强 而且其荧光强度与其溶液浓度呈线性 关系 因此可以用荧光光谱法测 VB2的含量 三 仪器和试剂三 仪器和试剂 1 仪器 荧光光度计 荧光比色皿 棕色容量瓶 移液管 试剂 核黄素 VB2药片 2 10 0 mg LVB2标准溶液 准确称取 10 0 mgVB2 将其溶解于少量的 1 HAc 中 转移至 1 L 容量瓶中 用 1 HAc 稀释至刻度 摇匀 该溶液应装于棕色试 剂瓶中 置阴凉处保存 3 待测液 取市售 VB2一片 用 1 HAc 溶液溶解 定容成 1000 ml 贮于棕 色试剂瓶中 置阴凉处保存 四 实验步骤四 实验步骤 1 打开电脑 打开荧光分光光度计电源 打开仪器光谱扫描软件 2 点击 Setup 图标 选择模式 设置仪器参数 扫描VB2的激发光谱和发 射光谱 确定最佳激发波长和发射波长 3 标准溶液的测定 开启标准曲线模式 设置适当的仪器参数 从稀到浓 测量系列标准溶液的荧光强度 得到VB2的浓度与荧光强度的线性回归方程 4 未知试样的测定 分别取待测液 2 和 4 mL 置于 100 mL 容量瓶中 用 1 HAc 稀释至刻度 摇匀 用测定标准系列时相同的条件 测量其荧光强度 5 测试完成后 取出比色皿 洗净 关上主机盖板 6 选择文件类型保存 关闭电脑 关主机电源 盖好仪器防尘罩 五 数据处理五 数据处理 1 根据 VB2的激光光谱和发射光谱确定 VB2的最佳激发波长和最大发射 波长 2 根据标准工作曲线上给出的样品浓度 计算 VB2药片中 VB2的含量 六 实验注意事项六 实验注意事项 1 在测试样品时 应注意样品的浓度不能太高 否则由于存在荧光猝灭效 应 样品浓度与荧光强度不呈线性关系 造成定量工作出现误差 2 在测定系列标准溶液的浓度和荧光强度时顺序要从稀到浓 必须按顺序 放入测定 3 拿取比色皿时 只能用手指接触两侧的毛玻璃 避免接触光学面 同时 注意轻拿轻放 防止外力对比色皿的影响 产生应力后破损 4 盛装溶液时 高度为比色皿的 1 2 处即可 光学面如有残液可先用滤纸 轻轻吸附 然后再用镜头纸或丝绸擦拭 5