b基因表达产物与心肌细胞缺血的关系及与a药物保护损伤的关系

遗传实验设计之B基因表达产物与心肌细胞缺血的关系及与A药物保护损伤的关系,实验目的,已知：（1）A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用；（2）心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变需明确：（1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系？（2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中？,2017年12月24日5时14分,2,实验原理,2017年12月24日5时14分,3,免疫组化化学（immunocytochemistry）将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再与标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链酶亲和素等）结合，最后通过显色反应或荧光来显示细胞中抗原（多肽、蛋白质等），在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，籍此对细胞内某抗原作定性、定位以及定量检测。,实验原理,2017年12月24日5时14分,4,SABC技术即链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术，其特点是利用链霉亲和素分别连接生物素标记的二抗和生物素标记的酶。由于链霉亲和素对生物素分子有极高的亲和力（是一般抗原抗体亲和力的一百万倍），其对组织和细胞的非特异吸附很低，因此背景很低，具有高敏感性、低背景和操作简便的优点。,实验原理,2017年12月24日5时14分,12307100162 临八 蒋逸雯,5,体外建立心肌细胞缺血模型取新生SD乳鼠的心肌细胞进行培养，以缺血液（无糖）及高纯氮气（95%N2、CO2）持续通气，来建立心肌细胞的缺血模型。体外建立的心肌细胞缺血模型可以从细胞水平来研究心肌细胞缺血过程中发生的变化及反应。,实验器材及试剂,2017年12月24日5时14分,12307100162 临八 蒋逸雯,6,仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜、湿盒材料：乳鼠心肌细胞试剂：甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DAB、0.3% H2O2-PBS、DMEM培养液、缺血液、II型胶原酶、透明质酸酶、A药物试剂说明PBS：磷酸盐缓冲液（0.01M,pH7.2）封闭液：5%牛血清白蛋白（BSA，即用型）一抗：小鼠IgG，用时PBS1:300稀释二抗：山羊抗小鼠IgG（生物素化）SABC：链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物DAB显色液试剂盒：3,3-二氨基联苯胺、TBS、H2O2,实验操作,2017年12月24日5时14分,12307100162 临八 蒋逸雯,7,B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系（1）心肌细胞的培养：接种小鼠心肌细胞于四组不同的96孔板（对照组、缺血1h组、缺血2h组和缺血4h组），每组3孔，37C、5%CO2孵箱中培养，24h后换液一次。（2）体外心肌细胞缺血模型的建立：吸弃原培养液，PBS洗三次（洗时轻轻晃动96孔板）。向缺血1h、2h、4h组加入缺血液，对照组依然加入DMEM培养液。将缺血组96孔板放入缺氧装置中，冲入高纯氮气（95%N2、CO2），流量10L/min，大约30min左右，同时关闭进气口与出气口，放入孵箱中培养。分别培养至预计时间后取出。,实验操作,2017年12月24日5时14分,12307100162 临八 蒋逸雯,8,（3）固定：吸弃培养液，PBS洗，轻轻摇动后小心吸弃，重复3次，加入甲醇固定5min。（4）封闭：PBS洗3次，加入25l封闭液，37C培养30min，吸弃上清液。（5）一抗：每孔加一抗25l，37C培养2h后置于4C冰箱过夜。（6）二抗：吸弃上清液并用PBS洗3次，加入二抗25l，37C培养2h。（7）吸弃上清液，PBS洗3次，加入30 l0.3% H2O2-PBS，37C培养30min。（8）吸弃上清液，PBS洗3次，加入25lSABC工作液，37C培养30min。（9）吸弃上清液，PBS洗3次，用三蒸水稀释DAB显色液，混匀后加入96孔板，每孔25l，镜下控制，细胞被染上色后，即以蒸馏水终止反应。（10）吸弃上清液，加入适量蒸馏水，观察结果。,实验操作,2017年12月24日5时14分,12307100162 临八 蒋逸雯,9,B基因的表达产物是否参与A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程（1）传代：传代心肌细胞至96孔板，分四组（对照组（缺血、不给药）、加A药物20mol/l、40mol/l、60mol/l），每组3孔。（2）体外心肌细胞缺血模型的建立：培养24h后，吸弃原培养液，加入适量缺血液，实验组分别加入浓度为20mol/l、40mol/l、60mol/l的A药物，96孔板放入缺氧装置中，冲入高纯氮气（95%N2、CO2），流量10L/min，大约30min左右，同时关闭进气口与出气口，放入孵箱中培养4h后取出。,实验操作,2017年12月24日5时14分,12307100162 临八 蒋逸雯,10,（3）免疫组化化学技术：吸弃缺血液，PBS洗3次，甲醇固定5min；PBS洗3次，加入25l封闭液，37C培养30min；吸弃上清液，加一抗25l，37C培养2h后置于4C冰箱过夜； PBS洗3次，加入二抗25l，37C培养2h；PBS洗3次，加入25lSABC工作液，37C培养30min；PBS洗3次，用三蒸水稀释DAB显色液，混匀后每孔加入25l，镜下控制，细胞被染上色后，即以蒸馏水终止反应；吸弃上清液，加入适量蒸馏水，观察结果。,设想结果,2017年12月24日5时14分,12307100162 临八 蒋逸雯,11,B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系B基因的表达产物B蛋白通过染色应染为棕色，通过观察染色的深浅及染色细胞的密度可以分析B蛋白的数量。通过观察四组结果，可以判断B蛋白即B基因表达产物，与心肌细胞缺血