实验总结-Western-blot

Western Blot Western Blot 法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 被检测物是蛋白质 探针 是抗体 显色 用标记的二抗 经过 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离的蛋 白质样品 转移到固相载体 例如硝酸纤维素薄膜 上 固相载体以非共价键 形式吸附蛋白质 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变 以固相 载体上的蛋白质或多肽作为抗原 与对应的抗体起免疫反应 再与酶或同位素 标记的第二抗体起反应 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性 目的基因表达的蛋白成分 该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达 WB 蛋白提取蛋白提取 大部分蛋白质都可溶于水 稀盐 稀酸或碱溶液 少数与脂类结合的蛋白质则 溶于乙醇 丙酮 丁醇等有机溶剂中 因些 可采用不同溶剂提取分离和纯化 蛋白质及酶 一 水溶液提取法 一 水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好 溶解度大 是提取蛋白质最常用 的溶剂 通常用量是原材料体积的 1 5 倍 提取时需要均匀的搅拌 以利于蛋 白质的溶解 提取的温度要视有效成份性质而定 一方面 多数蛋白质的溶解 度随着温度的升高而增大 因此 温度高利于溶解 缩短提取时间 但另一方 面 温度升高会使蛋白质变性失活 因此 基于这一点考虑提取蛋白质和酶时 一般采用低温 5 度以下 操作 为了避免蛋白质提以过程中的降解 可加入 蛋白水解酶抑制剂 PMSF 下面着重讨论提取液的 pH 值和盐浓度的选择 1 pH 值 蛋白质 酶是具有等电点的两性电解质 提取液的 pH 值应选择在偏离等电点 两侧的 pH 范围内 用稀酸或稀碱提取时 应防止过酸或过碱而引起蛋白质可 解离基团发生变化 从而导致蛋白质构象的不可逆变化 一般来说 碱性蛋白 质用偏酸性的提取液提取 而酸性蛋白质用偏碱性的提取液 2 盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶解 称为盐溶作用 同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质 部分结合 具有保护蛋白质不易变性的优点 因此在提取液中加入少量 NaCl 等 中性盐 一般以 0 15mol l 浓度为宜 缓冲液常采用 0 02 0 05M 磷酸盐和碳酸 盐等渗盐溶液 二 有机溶剂提取法 二 有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶 不溶于水 稀盐溶液 稀酸或稀碱中 可用乙醇 丙酮和丁醇等有机溶剂 它们具的一定 的亲水性 还有较强的亲脂性 是理想的提脂蛋白的提取液 但必须在低温下 操作 丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越 一是因 为丁醇亲脂性强 特别是溶解磷脂的能力强 二是丁醇兼具亲水性 在溶解度 范围内不会引起酶的变性失活 另外 丁醇提取法的 pH 及温度选择范围较广 也适用于动植物及微生物材料 一 单层贴壁细胞总蛋白的提取一 单层贴壁细胞总蛋白的提取 1 倒掉培养液 并将培养皿倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液 2 每皿细胞加 1ml 4 预冷的 PBS 0 01M pH7 2 7 3 平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞 然后弃去洗液 重复以上操作两次 共洗细胞三次以洗去培养 液 将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上 3 按 1 ml 裂解液加 10 PMSF 100 mM 摇匀置于冰上 PMSF 要摇匀至 无结晶时才可与裂解液混合 4 每皿细胞加 400 l 含 PMSF 的裂解液 于冰上裂解 30 min 为使细胞充分 裂解培养皿要经常来回摇动 5 裂解完后 用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧 动作要快 然后用枪 将细胞碎片和裂解液移至 1 5 ml 离心管中 整个操作尽量在冰上进行 6 于 4 下 12000rpm 离心 5 min 提前开离心机预冷 7 将离心后的上清分装转移倒 0 5 ml 的离心管中放于 20 保存 二 组织中总蛋白的提取 二 组织中总蛋白的提取 1 将少量组织块置于 1 2 ml 匀浆器中球状部位 用干净的剪刀将组织块尽量 剪碎 2 加 400 单去污剂裂解液裂 含 PMSF 于匀浆器中进行匀浆 然后置于冰 上 3 几分钟后再碾一会儿再置于冰上 要重复碾几次使组织尽量碾碎 4 裂解 30 min 后 即可用移液器将裂解液移至 1 5 ml 离心管中 然后在 4 下 12000rpm 离心 5 min 取上清分装于 0 5 ml 离心管中并置于 20 保存 三 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取 三 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取 由于受药物的影响 一些细胞脱落下来 所以除按 一 操作外还应收集培养 液中的细胞 以下是培养液中细胞总蛋白的提取 1 将培养液倒至 15 ml 离心管中 于 2500rpm 离心 5 min 2 弃上清 加入 4 ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤 然后 2500rpm 离心 5 min 弃上清后用 PBS 重复洗涤一次 3 用枪洗干上清后 加 100 裂解液 含 PMSF 冰上裂解 30 min 裂解过程 中要经常弹一弹以使细胞充分裂解 4 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起 4 12000rpm 离心 5 min 取上清分装 于 0 5 ml 离心管中并置于 20 保存 可在蛋白浓度测定结束后用 SDS 稀释蛋白后再保存 WB BCA 蛋白含量测定蛋白含量测定 一 原理 BCA bicinchonininc acid 与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂 混合一 起即成为苹果绿 即 BCA 工作试剂 在碱性条件下 BCA 与蛋白质结合时 蛋 白质将 Cu 2 还原为 Cu 一个 Cu 螯合二个 BCA 分子 工作试剂由原来的苹 果绿形成紫色复合物 该水溶性的复合物在 562nm 处显示强烈的吸光性 吸光 度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系 因此根据吸光值可以推算出蛋 白浓度 二 产品特点 1 步骤简单 45 分钟内完成测定 比经典 Lowry 法快 4 倍而且更加方便 2 灵敏度高 检测浓度下限达到 25ug ml 最小检测蛋白量达到 0 5ug 待测样 品体积为 1 20ul 3 在 50 2000ug ml 浓度范围内有良好的线性关系 4 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量 三 注意事项 1 蛋白标准品需在全部溶解后先混匀 再稀释再稀释成一系列不同浓度的蛋白 标准 标准品曲线配制时 如果吸量不准确或者加样枪不精确会造成标准曲线 相关系数减小 可根据需要使用倍比梯度稀释的方法来配制 或者使用精确度 高的加样枪 2 Solution A 和 Solution B 混合成工作液时可能会有浑浊 但充分振荡混匀后就 会消失 成为淡绿色的透明溶液 3 需酶标仪一台 测定波长为 540 590nm 之间 562nm 最佳 需 96 孔板 如 果没有酶标仪 也可以使用普通的分光光度计测定 但是测定蛋白浓度时 需 根据测定吸光度的杯子的体积 按比例调整 A 液 B 液和样品的体积 使用分 光光度计测定蛋白浓度时 每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少 4 BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响 可以兼容样品 中高达 5 的 SDS 5 的 Triton X 100 5 的 Tween 20 60 80 但受螯合剂和略 高浓度的还原剂的影响 需确保 EDTA 低于 10mM 无 EGTA 二硫苏糖醇低于 1mM 巯基乙醇低于 1mM 不适用 BCA 法时建议使用 Bradford 蛋白浓度测定 试剂盒 还可以考虑用超纯水稀释 透析 除盐 ACETONE TCA 沉淀蛋白后重溶 于超纯水等方法来消除干扰物质的影响 5 为了加快 BCA 法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热 但是切勿过热 6 如发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景 可试用 Bradford 法蛋白定量 四 操作步骤 1 使用时将 Solution A 摇晃混匀 根据样品数量 按 50 体积 Solution A 加 1 体积 Solution B 50 1 配制适量 BCA 工作液 充分混匀 BCA 工作液室温 24 小时内稳定 2 蛋白标准品 0 5mg ml BSA 取 10ul 蛋白标准品 5mg ml 稀释至 100ul 使 终浓度为 0 5mg ml 蛋白样品在什么溶液中 蛋白标准品也宜用什么溶液稀释 但是为了简便起见 也可以用去离子水 0 9 NaCl 或 PBS 稀释蛋白标准品 3 标准曲线的绘制 取一块酶标板 按照下表加入试剂 孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液 L 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水 L 20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量 g 0 0 5 1 0 2 0 4 0 6 0 8 0 10 0 4 加适当体积 1 l 样品到 96 孔板的样品空中 加标准品稀释液到 20 微升 5 各孔加入 200 L BCA 工作液 37 放置 30 分钟 然后在 562nm 下酶标仪比色 测定 也可以在室温放置 2 小时 或 60 放置 30 分钟 BCA 法测定蛋白浓度时 吸光度会随着时间的延长不断加深 并且显色反应会因温度升高而加快 如果 浓度较低 适合在较高温度孵育 或延长孵育时间 6 BCA550 以蛋白含量 g 为横坐标 吸光值为纵坐标 绘出标准曲线 根据所测样品的吸光值 在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量及浓度 乘以 样品稀释倍数即为样品实际浓度 WB SDS PAGE 电泳电泳 1 原理 聚丙烯酰氨凝胶 PAGE 电泳 是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种 常用电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成 聚合过程由自由基催化完成 催化聚合的常用方法有两种 化学聚合法和光聚 合法 化学聚合以过硫酸铵 APS 为催化剂 以四甲基乙二胺 TEMED 为加 速剂 在聚合过程中 TEMED 催化过硫酸铵产生自由基 后者引发丙烯酰胺单 体聚合 同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联 从而形成三维 网状结构 具有分子筛效应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时 它的迁移率取决于它所带净电荷以及 分子的大小和形状等因素 如果加入一种试剂使电荷因素消除 那电泳迁移率 就取决于分子的大小 就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量 1967 年 Shapiro 他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂巯 基乙醇 SDS 即十二烷基硫酸钠 后 蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚 基分子量的大小 可以忽略电荷因素 强还原剂如巯基乙醇 二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂 SDS 是阴离子去污剂 作为变性剂和助溶试剂 它能断裂分子内和分子间的氢键 使分子去折叠 破坏蛋白分子的二 三级结构 由于十二烷基硫酸根带负电 在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS 后 分子 被解聚成多肽链 解聚后的氨基酸侧链和 SDS 结合成蛋白 SDS 胶束 使各种 蛋白质 SDS 复合物都带上相同密度的负电荷 它的量大大超过了蛋白质分子 原的电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别 SDS 与蛋白质结合 后 还可引起构象改变 蛋白质 SDS 复合物形成近似 雪茄烟 形的长椭圆 棒 不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样 约为 18A 1A 10 的负十次方 米 这样的蛋白质 SDS 复合物 在凝胶中的迁移率 不再受蛋白质原的电 荷和形状的影响 而取决于分子量的大小由于蛋白质 SDS 复合物在单位长度 上带有相等的电荷 所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶 进入分 离胶后 由于聚丙烯酰胺的分子筛作用 小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶 孔径 阻力小 迁移速度快 大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后 这样 蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离 浓缩胶的作用是有堆积作用 凝胶浓度较小 孔径较大 把较稀的样品加 在浓缩胶上 经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带 当样品 液和浓缩胶选 TRIS HCl 缓冲液 电极液选 TRIS 甘氨酸 电泳开始后 HCl 解 离成氯离子 甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子 蛋白质带负电荷 因此一起 向正极移动 其中氯离子最快 甘氨酸根离子最慢 蛋白居中 电泳开始时氯 离子泳动率最大 超过蛋白 因此在后面形成低电导区 而电场强度与低电导 区成反比 因而产生较高的电场强度 使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动 形成 一稳定的界面 使蛋白聚集在移动界面附近 浓缩成一中间层 SDS PAGE 一般采用的是不连续缓冲系统 与连续缓冲系统相比 能够有较 高的分辨率 PAGE 根据其有无浓缩效应 分为连续系统和不连续系统两大类 连续系统 电泳体系中缓冲液 pH 值及凝胶浓度相同 带电颗粒在电场作用下 主要靠电荷 和分子筛效应 不连续系统中由于缓冲液离子成分 pH 凝胶浓度及电位梯度 的不连续性 带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应 分子筛效应 还具有浓 缩效应 因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 不连续体系由电极缓冲 液 浓缩胶及分离胶所组成 浓缩胶是由 AP 催化聚合而成的大孔胶 凝胶缓冲 液为 pH6 7 的 Tris HCl 分离胶是由 AP 催化聚合而成的小孔胶 凝胶缓冲液 为 pH8 9 Tris HCl 电极缓冲液是 pH8 3 Tris 甘氨酸缓冲液 2 种孔径的凝 胶 2 种缓冲体系 3 种 pH 值使不连续体系形成了凝胶孔径 pH 值 缓冲液离 子成分的不连续性 这是样品浓缩的主要因素 因而 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量 当分子量在 15KD 到 200KD 之间时 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系 符合下式 logMW K bX 式中 MW 为分子量 X 为迁移率 k b 均为常数 若将已知分子 量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图 可获得一条标准曲线 未知蛋白 质在相同条件下进行电泳 根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测 纯化的蛋白质通 常在 SDS 电泳上应只有一条带 但如果蛋白质是由不同的亚基组成的 它在电 泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有 较高的灵敏度 一般只需要不到微克量级的蛋白质 而且通过电泳还可以同时 得到关于分子量的情况 这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常 重要的 2 试剂作用 1 过硫酸铵 APS 为催化剂 2 四甲基乙二胺 TEMED 为加速剂 APS 提供自由基 TEMED 催化剂 催化自由基引起的聚合反应 在聚合 过程中 TEMED 催化过硫酸铵产生自由基 后者引发丙烯酰胺单体聚合 同时 甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联 从而形成三维网状结构 3 SDS 是阴离子去污剂 作为变性剂和助溶试剂 它能断裂分子内和分子间的 氢键 去蛋白质电荷 取消蛋白分子内的疏水作用 去多肽折叠 破坏蛋白分 子的二 三级结构 4 强还原剂如巯基乙醇 二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂 在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS 后 分子被解聚成多肽链 解聚后的氨基酸 侧链和 SDS 结合成蛋白 SDS 胶束 所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量 这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异 5 聚丙烯酰胺 为蛋白质电泳提供载体 其凝固的好坏直接关系到电泳成功 与否 与促凝剂及环境密切相关 凝胶浓度 分子量范围 KB 525 200 1010 70 15 50 20 滤纸 PVDF 膜 4 用镊子捏住 NC 膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里 要使膜浮于水上 只 有下层才与水接触 这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿 若膜沉入水里 膜与水之间形成一层空气膜 这样会阻止膜吸水 PVDF 膜需用甲醇激活 15s 5 将夹子打开使黑的一面保持水平 在上面垫一张海绵垫 用玻棒来回擀几 遍以擀走里面的气泡 在垫子上垫三层滤纸 一手固定滤纸一手用玻棒擀 去其中的气泡 气泡易导致短路 6 要先将玻璃板撬掉才可剥胶 撬的时候动作要轻 要在两个边上轻轻的反 复撬 撬一会儿玻璃板便开始松动 直到撬去玻板 7 除去小玻璃板后 将浓缩胶轻轻刮去 要避免把分离胶刮破 小心剥下分 离胶盖于滤纸上 用手调整使其与滤纸对齐 轻轻用玻棒擀去气泡 将膜 盖于胶上 要盖满整个胶 膜盖下后不可再移动 并除气泡 8 在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡 最后盖上另一个海绵垫 擀几下就可合起 夹子 整个操作在转移液中进行 要不断的擀去气泡 9 如果同时做两块胶 转膜结束应在膜上做标记 以便查询相应样本 10 转膜结束前配制封闭液及 1XTBST 缓冲液 10X 稀释 三 步骤 1 电泳结束前 20 分钟左右戴上手套开始准备 将转膜夹 切胶板等放在转膜 液终浸湿 2 常用湿转 使用常规 1X 电转液 现配 一般配制成 10 转膜缓冲液储存 需要时配制成 1 现用 3 浸泡 NC 膜 将 NC 膜平铺于去离子水面 靠毛细作用自然吸水后再完全浸 入水中 10min 以排除气泡 随后浸泡入转移液中 PVDF 膜则在甲醇中浸泡 15s 后转入转移液中平衡 使条带不下弯 将滤纸也浸入转移液中 在膜的一角切角做标记 4 取胶 将胶卸下 根据所需蛋白分子量保留一定长度的胶 左上切角 做 标记 在转移液中稍稍浸泡一下 置于洁净玻璃板上 按顺序铺上膜与 每侧一张滤纸 注意用玻棒逐出气泡 剪去滤纸与膜的过多部分 尤其是 干转 以防止短路 夹紧转膜夹后 5 转膜 湿转 电转槽用双蒸水淋洗晾干 加入 1 000ml 电转液 将转膜夹封紧后 放入电转槽 要使夹的黑面对槽的黑面 夹的白面对槽的红面 电转移 时会产热 在槽的一边放一块冰来降温 将电泳槽置于冰水混合物中 根 据蛋白分子量的大小确定转膜时间 对于小分子量的蛋白 转膜时可垫两 块硝纤膜 以免转膜过头 因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了 第 二张膜上还有蛋白质可以进行检测 对于大分子量的蛋白 转膜时电压 要高一点 一般 80 100 V 时间也要延长一点 特别是务必注意加强降温 措施 干转 用电转液淋洗石墨电极 滤纸吸干 铺上胶 再滴少许电 转液 以 1 5mA cm2 凝胶面积转移 1 2 小时 负载电压不宜超过 1V cm2 胶 面积 WB 封闭及杂交封闭及杂交 封闭 转移后的膜就称为一个印迹 blot 用于对蛋白质的进一步检测 将膜用 TTBS 从下向上浸湿后 移至含有封闭液 常用脱脂奶粉或 5 BSA 磷酸化的蛋 白一般首选 BSA 封闭 的平皿中 室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h 必要时可 先用丽春红染色 2 乙酸 0 5 丽春红的水溶液 观察蛋白条带 再用去离 子水和 TTBS 将丽春红洗脱后封闭 如用蛋白 marker 则可省略此步 原理 1 封闭液中的蛋白填塞入膜孔道 封闭膜上疏水结合位点即无蛋白转移区 这样一抗孵育时起到减轻背景作用 2 封闭液与抗原结合只是非特异性结合膜表面抗原 在一抗孵育情况下大部 分可以竞争性的与抗原结合 而此时的一抗和奶粉对杂带的作用均为非特 异性的作用 所以奶粉封闭后可以减少杂带的显色 封闭时间长 条带变 弱 此时可以延长漂洗和一抗孵育的时间 免疫杂交 原理 1 印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物 而其它 的蛋白质不能与一抗结合 这样清洗除去未结合的一抗后 印迹中只有待 研究的蛋白质的位置上结合着一抗 2 处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理 二抗是指一抗的抗体 如 一抗是从鼠中获得的 则二抗就是抗鼠 IgG 的抗体 处理后 带有标记 的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置 即是待研究的蛋 白质的位置 3 目前有结合各种标记物的抗体特定 IgG 的抗体 二抗 可以直接购买 最 常用的一种是酶连的二抗 印迹用酶连二抗处理后 再用适当的底物溶液 处理 当酶催化底物生成有颜色的产物时 就会产生可见的区带 指示所 要研究的蛋白质位置 步骤 一抗孵育 1 从封闭液中取出膜 1X TBST 5 10minX3 次 2 将一抗用封闭液稀释至适当浓度 3 将膜蛋白面朝上放于槽中 加入抗体 4 度孵育过夜 4 次日用 1X TBST 在室温下脱色摇床上洗三次 每次 5 10min 孵育时间 一抗的孵育时间可从几小时至过夜 一般不超过 18 小时 不等 取 决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度 建议使用较高的抗体稀释倍数和 较长的孵育时间来保证特异性结合 孵育温度 尽可能低温孵育 如果在封闭液中孵育一抗过夜 应在 4 度进行否 则会产生污染而破坏蛋白 降别是磷酸基团 二抗孵育 1 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触 室温下孵育 1h 2 用 1X TBST 在室温下脱色摇床上洗三次 每次 5 10min WB 发光鉴定发光鉴定 原理 经过 PAGE 分离的蛋白质样品 转移到固相载体 例如硝酸纤维素薄膜 上 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质 且能保持电泳分离的多肽类型及其 生物学活性不变 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原 与对应的抗体起免 疫反应 再与酶或同位素标记的第二抗体起反应 经过底物显色或放射自显影 以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分 在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶 AP 或辣根过氧化物酶 HRP 碱 性磷酸酶可以将无色的底物 5 溴 4 氯吲哚磷酸盐 BCIP 转化为蓝色的产物 而辣根过氧化物酶可以将 H2O2 为底物 将 3 氨基 9 乙基咔唑氧化成褐色产物 或将 4 氯萘酚氧化成蓝色产物 另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化 学发光法 辣根过氧化物酶在 H2O2 存在下 氧化化学发光物质鲁米诺并发光 通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在 即目标 蛋白质的存在了 步骤 1 将两种显色底物 1 1 等体积混合 一般各 1ml 2 将混合物覆盖在膜表面 1 2 分钟 摇晃使均匀 3 用胶片夹把膜包起来 期间膜不可以干 放入曝光仪中 4 根据结果调整曝光时间和曝光强度 得到最佳结果 导出并保存 问题问题 可能可能 原因原因 建议建议 电泳条带成笑脸状 胶不均匀冷切 中间冷却不好 电泳 系统温度偏高 减少电压减慢电泳速度 在冷室 或者冰浴中进行电泳 电泳条带成皱眉状 可能是由于装置不合适 特别可能是 凝胶和玻璃挡板底部有气泡 或者两 边聚合不完全 调整装置 拖尾样品溶解不好样品充分溶解混匀后上样 纹理 纵向条纹 样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀 条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样 条带两边扩散加样量过多适当减少上样量 Marker 变黑色抗体和 Marker 蛋白反应 在 Marker 和 sample 之间空出 一个孔不上样 膜封闭不够 延长封闭时间 选择最适宜的抗 体稀释度 一抗稀释度不适宜 对抗体进行滴度测试 选择最适 宜的抗体稀释度 一抗孵育的温度偏高建议 4 结合过夜 二抗浓度度过高降低二抗浓度 二抗的非特异性背景 增加一个二抗对照 不加一抗 其他操作过程不变 即可验证背 景是否是由于二抗所致 可选择 其它二抗 特异性更强的 只针 对重链 二抗孵育时间过久减少二抗孵育时间 选择膜的问题 硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜 低 膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润 检测时曝光时间过长注意曝光时间的缩短 洗膜不充分增加洗膜的时间和次数 背景高 抗体和封闭蛋白有交叉反应 检测抗体与封闭蛋白的交叉反应 性 选择无交叉反应的封闭剂 洗涤液中加入 Tween 20 可减少 交叉反应 杂带较多 目的蛋白有多个修饰位点 磷酸化位 点 糖基化位点 乙酰化位点等 本身可以呈现多条带 查阅文献或进行生物信息学分析 获得蛋白序列的修饰位点信息 通过去修饰确定蛋白试剂大小 目的蛋白有其他剪切本 查阅文献或生物信息学分析可能 性 样品处理过程中目的蛋白发生降解 裂解液中加入蛋白酶抑制剂 样 品处理在冰上进行 上样量过高 太敏