发酵工程实验技术实验指导(2013年学生版).doc

发酵工程实验技术实验指导贵 州 大 学生命科学学院二零壹叁年叁月目 录目 录 1实验一 小型发酵罐的构造.2实验二 枯草杆菌的发酵生产.6实验三 抗生素的检测 .13 实验一 L1523型小型发酵罐的构造一、实验目的 熟悉小型发酵罐的构造，了解发酵罐各种构造的功能。二、小型发酵罐的构造 小型发酵罐是实验室进行小规模试验研究的必备装置，图1所示为瑞士比欧生物工程公司生产的L1523型小型发酵罐、主要由罐体、通气系统、搅拌系统、加热及控温系统、监测及控制系统等几个部分组成。蠕动泵溶氧控制器pH控制器温度控制器发酵罐电源开关搅拌器转速控制器空气过滤器热循环泵搅拌电机排气管空气过滤器安全阀压力表罐盖玻璃罐体挡板空气进气管 搅拌器及搅拌电机加热器图1 L1523型发酵罐的外观 图2 罐体外观 图3 罐体（vessel） 图4 罐盖（lid） 图5 罐底（bottom） 图6 搅拌器（disc turbine） 图7 防护罩（safety jacket） 图8加热器和直流电机（heater and AC motor） 图9 空压机（air compressor） 图10 安全阀（safety valve）1.罐体 罐体是发酵生产微生物菌体或代谢产物的场所，一般由不锈钢、陶瓷或特种玻璃制成，其体积根据需要可从0.1升到100升不等。L1523型发酵罐的体积为19升，发酵罐的外形参见图2，由罐盖（图4）、罐体（图3）和罐底（图5）组成。（1）罐盖：由耐腐蚀的不锈钢构成，其上有十二个圆孔，分别用于安装pH探头、温度探头、溶解氧探头、气压表、调节pH的补酸、补碱管、排气管过滤器、通气管、放样管和安全阀（图10），靠近外侧的两个孔一般用塞子塞住，主要用于接种、加消泡剂等。（2）罐体：由耐高温、高压的特种玻璃制成，其内有各种探头、通气管、放样管、搅拌器（图6）和挡板等。（3）罐底：由具夹层的不锈钢制成，夹层内与加热器和冷却水联通，通过此夹层与发酵罐进行热交换，以控制罐内温度。搅拌器也是通过罐底进入罐体的，称为下搅拌，此外在罐底还有空气分布器，能使压缩空气均匀分布于发酵罐中。2.通气系统 L1523型发酵罐适用于好气性微生物的发酵生产，其空气来源于空气压缩机（图9）。由空压机压缩的高压空气经除油、除水和减压装置减压后，通过预先灭菌的空气过滤器过滤除菌，然后再经空气分布器、搅拌器和挡板等的共同作用，使无菌空气均匀地分布到整个发酵罐。3.搅拌系统 发酵罐的搅拌装置可分为上搅拌和下搅拌两种类型，L1523型发酵罐属于下搅拌，其搅拌器（图6）由搅拌电机（图8）驱动，转速高达1000rpm。4.加热与控温系统 L1523发酵罐为原位灭菌发酵罐，利用自带的小型加热器(锅炉，图8)，可进行培养基的灭菌和保温，再借助于冷却水(自来水)可使发酵罐内的灭菌温度和发酵温度精确地保持恒定(误差为0.1)。5.监测及控制系统 小型发酵罐一般都配备有监测控制系统，可以监测和控制搅拌器的转速、灭菌和发酵的温度、pH值、溶解氧量等。L1523型发酵罐可通过计算机实现自动控制，中间可借助蠕动泵和补料系统自动补料和调节pH值等。 实验二 枯草杆菌的发酵生产一、实验目的 1、通过实际操作进一步熟悉小型发酵罐的构造；2、掌握小型发酵罐的使用方法；了解微生物发酵生产的方法。3、掌握研究型实验论文报告的撰写二、实验器材的准备（一）培养基的制备与灭菌1.斜面菌种培养基 牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，水1000ml，pH7.27.4，0.1Mpa，121，灭菌30min。 每组配制500ml固体培养基，分别装入20支15150mm试管(每管约5ml)和3个250ml三角瓶中，然后包装、灭菌。试管摆成斜面。2.三角瓶种子培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基：配方同上，但不加琼脂。 每组配制上述液体培养基1000ml，分装到10个250ml三角瓶中，每瓶100ml。灭菌方法同上。（二）其他实验器材的准备1.1ml无菌吸管 每组30支，于0.1Mpa，121灭菌30分钟。2.无菌水 18180mm试管，每支装9ml水，每组40支，于0.1Mpa，121灭菌30分钟（作标准曲线10倍稀释法用）；另配3-5个三角瓶无菌水（总1升）；另配10余支4.5ml 15150mm (稀释、抑菌试验作对照，洗菌（枯草芽孢杆菌洗菌接种、黑曲霉洗菌涂布等）。3无菌培养皿 每组40套，于0.1Mpa，121灭菌30分钟。4.无菌大试管（18180mm试管） 每组20个，于0.1Mpa，121灭菌30分钟。主要用于发酵液取样方便，量足，取样时接近1/2。不够再灭菌使用。5.无菌吸管（可用无菌枪头取代，用于吸少量液体涂布和作抑菌试验等）。 1ml吸管，每组20支，于0.1Mpa，121灭菌30分钟。6.空气过滤器的灭菌 将空气过滤器针尖先用纱布包扎好，然后再用包装纸和绳子将空气过滤器整体包装好，于0.1Mpa，121灭菌30分钟。7.牛津杯的灭菌将36只牛津杯装入培养皿中，每皿10只，用包装纸包装好，于0.1Mpa，121灭菌30分钟。8.消泡剂的灭菌 量取100ml豆油倒入250ml三角瓶中（每组34瓶），包装好后于0.1Mpa，121，灭菌30分钟。9. 1N H2SO4和1N NaOH溶液灭菌，用来调节发酵过程中的pH。 10配制75%和95%的酒精棉球各一瓶三、细菌细胞浓度的测定（比浊法）1.标准曲线的制作 取无菌水9支，编号，将在30、150rpm条件下培养2022小时的枯草杆菌细胞按二倍系列稀释法进行适当稀释，使其浓度分别为原液、1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、1/12、1/16、1/32、1/64原液，同时以无菌水作为空白对照，利用分光光度计测定其在580nm波长下的O.D.值，并求出原液OD值的平均值；然后，采用平板菌落计数法（注意：这是十倍稀释法）测定其中的细胞数量（大约10-6、10-7、10-8，如太浓则10-7、10-8、10-9，每一个梯度用三个重复），换算出原液细胞数量的平均值。（注：为保证标准曲线成功率，加之不知何种浓度稀释适于涂布平板计数，建议10-5、10-6、10-7、10-8、10-9各个梯度各3个重复，如果还不成功，则可减少梯度，如选10-6、10-7、10-8三个梯度3重复再作一次，具体情况视前面平板的菌落长相而定其梯度，但保证三个重复以保证其成功率同学总有一两个何等的不好，故）。编 号1234567空白细胞数/mlO.D.以O.D.值作为纵坐标，每ml样品中的细胞数作为横坐标，曲线换算，绘制标准曲线。2.发酵液细胞浓度的测定 从取样管放出10ml左右的发酵液至无菌大试管（18180mm试管）中，在580nm波长下，测定发酵液的O.D.值，对照标准曲线，可知该发酵液的细胞浓度。四、发酵生产1.斜面菌种的培养 将已活化两次的试管斜面菌种接种到试管斜面上，30培养1820小时，即为斜面菌种。2.三角瓶种子的培养 将试管斜面用4.5ml无菌水洗下，然后接种到250ml三角瓶培养基中，每瓶一管，接三瓶，于30，150rpm条件下，振荡培养1820小时（一级种子）。由三角瓶移接入另外500ml三角瓶（或更多的250ml三角瓶）中扩大培养（此为二级种子），保证二级种子接种量7-10%（如13L发酵液则为910-1300ml左右，其中还包括预留一部分作标准曲线用）3.发酵培养基的灭菌 每组配制13L牛肉膏蛋白胨液体培养基（pH7.4），另再加0.1%的酵母膏，用乳胶管小心地加入发酵罐中，然后旋紧塞子，安装好防护罩（见图7），按下面的方法灭菌：（1）检查水、电、气以及发酵罐的密封性是否正常。如正常即可灭菌。（2）打开进水阀，调节水压使水压表指针指示在0.20.4之间，使水充满加热器，防止烧坏加热器。（出水阀近关闭情况下，达到0.4，此时出水阀虽然关闭，但进水阀打开，此外水压也满足要求，所以水能充满加热器不至于烧坏，当灭菌结束降温时，热水会走另一条旁路（非出水阀的另一条出口）泄压。）（3）打开发酵罐的总电源。（4）打开搅拌器的电源开关，使搅拌器转速控制在300rpm，培养时根据要求调整。（5）适当开启排气口排气，但应注意：排气口不能开得过大，否则，培养基的水分损失严重！（6）打开温度控制器的电源开关，将灭菌温度设定为121，灭菌时间设定为30min，发酵温度设定为30。启动灭菌开关，进行自动灭菌。注意：1.灭菌过程中决不能离开人！应随时观察发酵罐有无异常情况，如出现异常应及时请教师处理或关闭总电源。 2.发酵罐的玻璃不能接触冷水！ 3.发酵罐灭菌参数已经设置好，未经教师允许，不得随意改动！（7）灭菌结束后，发酵罐会自动降温，当温度低于95时，通过无菌操作，安装好已灭菌的空气过滤器，（即关上门窗，解开绳子，放好95%酒精在安装孔的周围，关上进气口，开大出气口，保证极低正压以保安全和防止杂菌落入罐内，先旋松螺盖，点燃95%酒精，在火上操作装上空气过滤器。工具有：尖嘴钳、镊子、95%和75%的酒精）然后，通入无菌空气，使培养基快速降温，并使发酵罐保持一定的正压，以减少污染。（8）当温度低于35时即可接种发酵。（操作同（7）里类似 ）4.接种在发酵罐的罐盖上选择一个塞子，先用75%的酒精棉球在其周围消毒，同时消毒尖嘴钳，然后在塞子周围放置吸满无水酒精的棉花，点燃酒精，用钳子小心打开塞子，取出置于火焰上，将三角瓶种子按5%的接种量迅速倒入发酵罐内，旋紧塞子。5.发酵在灭菌达到121时校正溶氧电极的读数为零，接种后当温度达到培养温度、搅拌速度稳定、通气量稳定时，校溶氧电极至95%以上。搅拌速度设定为350rpm，发酵温度设定为28，开始计时发酵。发酵时间根据细菌生长情况而定，一般约70小时。 发酵过程中，应注意：（1）溶解氧的斜率一般不得低于50%，否则需加大搅拌速度或适当增大通气量。（2）发酵过程中，应经常观察并记录发酵罐内部的变化情况，如泡沫过多，应及时消泡。消泡方法是采用无菌操作技术，打开发酵罐盖顶的一个塞子，加入消泡剂（豆油），每次用量视具体情况而定（20或30ml），但每批次发酵最多不超过400ml。（3）发酵过程中应及时记录发酵参数的变化情况。 发酵结束后，应及时的清洗发酵罐和实验用品。 注意：发酵罐体不能用盐酸清洗。 6.绘制枯草杆菌的生长曲线 发酵培养基接种后，从0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30、小时，分别取样测定发酵液的O.D.值，绘制出枯草杆菌的生长曲线。7.枯草杆菌的镜检发酵接种以后，12，24，36，每隔12小时芽孢染色镜检一次，观察芽孢和菌体情况（看芽孢何时长出来和芽孢何时脱落），确定是否可下罐（一般芽孢数多，且脱落宜下罐。） 实验三 抗生素的检测一、实验目的 通过实验掌握抗生素的一般检测方法。二、PDA培养基的制备称取去皮马铃薯200g，切片，放入小锅中，加入1000ml水，加热煮沸1015分钟，用8层纱布过滤。取滤液加入蔗糖20g、琼脂20g，加热熔化后补足水分（自然pH），然后，分装到20支15150mm试管（5ml/支）和6个250ml三角瓶（150ml/瓶）中，于0.1Mpa，121灭菌30分钟。三、抗生素的检测方法1.将黑曲霉用PDA培养基活化，然后接种到PDA试管斜面上，培养3648h。2.取3套无菌培养皿倒入PDA培养基，冷凝后置30温箱中过夜。3.将培养好的黑曲霉试管斜面用4.5ml无菌水洗下，然后将菌悬液分别倒入三套PDA平板上，用玻璃涂棒涂匀。（操作：吸0.3ml左右到一平板，涂布，其它平板相同操作）4.采用无菌操作，用无菌小镊子将牛津杯轻轻放在培养基上。每皿放两只，并作好标记（参见下图）。5.分别将发酵20、30、40、50、60、70h的发酵液用无菌18180mm大试管取出，用移液枪吸取0.250.3ml(0.5ml会溢出)发酵液至一只牛津杯内（发酵液可预先用离心管离心，10000转16分钟，吸中间清液，上层是油层，中层是清液，下层菌细胞，但尽量保证无菌，如离心管先用酒精擦洗一下为好），另一只加入0.250.3ml无菌水，共三个重复。6.静置30min，将培养皿小心放入30温箱中，培养48h，观察并记录抑菌圈的大小。 注意：实验过程中，尽量不要移动牛津杯！实验总提示：一、停电处理：全部开关（机器总开关、墙上总闸）关闭，把排气阀关闭，空压机关闭，等来电后恢复。二、停水处理：马上关闭温度控制开关（绿色键“on/off” ），把转速调低（如由350 调至300 rpm）,溶氧量的开关不关，把进气阀开大些，以增大通气量，出气阀门不调，空气压缩机继续工作。运行1小时左右，如还没来水，则关机（机器总开关由1置0），空压机可开着，出气阀不关，停机40、50分钟左右后，再开机，开转速开关（温控开关还是不打开），如此循环几次直至来水，恢复转速、温控、通气量等至正常即可。注意：一次性停水停电太久，停水停机大于3小时以上，实验可能会失败。三、当自然水压水压满足要求时(2-4Bar),不需要连接水泵。只有水压不足时才开启水泵（学校水压一般情况满足，不满足时有可能停水，所以不需用！这条可略）当使用水泵时注意水泵中无流动水通过造成水泵空烧烧毁。这方面具体应注意如下两种情况：A、 进水阀已关死，水源无法通过进水口进入水泵再从出水阀出来。表现出空烧而水泵烧坏，水泵线圈或电容都可能烧坏。此时水压表读数为零，排水口无水流出。B、进水阀正常，但是在调出水