第八章 土壤微生物

第八章 土壤微生物 华中科技大学同济医学院公共卫生学院 谷康定 树林土壤 土壤在自然环境中的位置 土壤是人类生活、生产最重要的环境之一，也是微生物生活的大本营和生物地球化学物质循环的最主要场所。 土壤作为影响人类健康的重要环境载体，特别是微生物在其中发挥的有益或有害作用是卫生微生物学重点关心和研究的内容之一。 根瘤 土壤生物 第一节 土壤生境特征 一、 土壤的固相成分 二、土壤的水分 三、土壤的空气 四、土壤的酸碱度 五、土壤的温度 六、土壤的其他因素 土壤是由固体、水份和空气组成的三相复合系统。与微生物密切相关的土壤生境主要包括以下几个方面： 一、土壤的固相成分 固相物质包括无机颗粒与有机物。土壤固相颗粒是土壤的物质基础，占土壤总重量的 95%以上。土壤颗粒的组成、性质及排列形式，决定了土壤的理化性质与生物特性。 矿物质中有微生物生长所必须的常量与微量元素，如磷、硫、钾、钠、铁、镁、钙、锌和锰等。 土壤有机质包括有机活体、分解与未分解的有机残体，简单有机化合物、酶和腐殖质，腐殖质是土壤有机质主要组成部分。有机质为微生物生长提供碳、氮和能量来源。有机质含量丰富的土壤，微生物数量就多，反之则少 。 有机质的分解与合成示意图 二、土壤的水分 土壤水分 (soil moisture)是土壤的液相组分，也是微生物进行物质交换的重要基质和生存的基本因素。土壤水分有利于矿物质养分的溶解和转化，有利于土壤中有机物的分解与合成，增加了土壤养分，有利于微生物利用和植物吸收。此外，土壤水分能调节土壤温度。 土壤水分的差异，导致土壤中微生物的种类和数量的差异。 三、土壤的空气 土壤空气主要来自大气。但土壤空气中的 O2 含量和 CO2含量与大气有很大的差异，土壤中 O2浓度一般为 10% 12%， CO2一般在 0.1%左右，这些浓度随季节、昼夜和深度而变化。 土壤空隙中的空气，是需氧微生物生长的氧气来源。空气的多少，影响土壤氧化还原条件，决定了土壤中的微生物类群。 土壤通气程度影响土壤微生物的种类、数量和活动情况。通气不良，抑制土壤中好气微生物活动，减慢了有机物的分解与营养物的释放；通气过分，使有机物分解速度过快，养分释放太快，而腐殖质形成减少， 厌气性微生物活动力弱，甚至会中毒死亡。 四、土壤的酸碱度 土壤一般呈中性或弱碱性，适合于大多数微生物的生长，这也是土壤中存在大量微生物的因素之一。过酸或过碱的土壤，超出了微生物适应范围，就会限制它们的生命活动。 土壤酸化 五、土壤的温度 土壤具有一定的保温性，使土壤温度在一年四季中的变化不大，有利于微生物的生长繁殖；如果温度超出其能忍受的最低或最高限度时，微生物就停止生长。 热带土壤的表层温度较高。 寒带地区深达数米的冻土带。 各类微生物生长的温度范围 类型 最低温度（ ） 最适温度（ ） 最高温度（ ） 高温性 30 45 55 70 80 中温性 5 25 37 45 50 低温性 0 10 15 25 30 六、土壤的其他因素 土壤的营养成分 C与 N元素是土壤中微生物生长最重要的限制性营养元素。土壤中很多微生物处在半饥饿蛰伏状态。但是，植物根际区域例外。 阳光 阳光通常只能照射在土壤的浅表层，所以光能营养型微生物也局限在此。 第二节 土壤微生物的来源、种类、分布及其卫生学意义 一、 土壤微生物的来源 二、土壤微生物的种类 三、土壤微生物的分布 四、土壤中的病原微生物及其危害 五、土壤微生物的卫生学意义 一、土壤微生物的来源 “ 土著”微生物类群 外来微生物 根据微生物的起源和对土壤环境的适应性分为： 二、土壤微生物的种类 土著微生物包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物和病毒（噬菌体），其中以细菌的数量最多，占土壤中微生物总数量的 70% 90%，其次是放线菌和真菌。 外来微生物可分为腐物寄生菌和致病菌，后者有一部分是来自人畜的排泄物，且往往带有致病性细菌、病毒、放线菌、真菌、寄生虫卵等。 土壤生物的主要类群 （一） 土壤中的微生物 土壤是微生物的天然培养基，因为它具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，因此是微生物生存的大本营，是人类最丰富的菌种资源库。 土壤各种微生物的含量比呈 10倍系列递减。 细菌（ 108） 放线菌（ 107） 霉菌（ 106） 酵母菌（ 105） 藻类（ 104） 原生动物（ 103）。 1.数量和种类 在肥土中 ， 微生物数在几亿几十亿个 /g；在贫瘠土中为几百万几千万个 /g。 从种类上看 ， 以细菌最多 ， 其次为放线菌 、真菌 ， 以及藻类 、 原生动物和微型后生动物等 。 2.分布 水平分布 不同类型的土壤中所含微生物不同。 直分布 同一土壤的不同深度，微生物的分布不同。 土壤是微生物生活的大本营 单体数量最多 生物多样性最复杂 生物量最大 土壤微生物 土壤中的微生物根据其对能源和营养的要求不同，可分为四种营养类型： 异养型 自养型 化能有机营养型 光能有机营养型 营养类型 化能无机营养型 光能无机营养型 呼吸类型 专性需氧微生物 专性厌氧微生物 兼性厌氧微生物 土壤中的微生物根据其对氧的需要程度的不同，可分为不同类型微生物 微需氧微生物 土壤细菌占土壤微生物总数的 70% 90%。 特性 A.单细胞 B.分裂生殖快 C.个体小 (4 5 m)，接近于土壤粘粒的大小。 D.以杆菌占优势 E.数量大，每克有几亿到 30亿个 10g肥沃土壤的细菌总数相当于全球人口的总数 （ 1）细菌 3.原核微生物 土壤中重要的各种细菌生理群： 纤维分解细菌 固氮细菌 硝化细菌 亚硝化细菌 硫化细菌 氨化细菌 在土壤碳 、 氮 、 磷 、 硫循环中担当重要 的角色 。 放线菌也是原核微生物 ， 菌丝比真菌细 ， 菌丝断裂为孢子每克土壤中的细胞数在 104 106变动 。 链霉菌属 ， 占 70% 90%；其次为诺卡氏菌属占10% 30%；小单胞菌属占第三位 ， 只有 1% 15%。 它们的大部分均属好氧腐生菌 。 产生抗生素 ， 对其他有害菌能起拮抗作用 。 高温型的放线菌在堆肥中对其养分转化起着重要作用 。 （ 2）放线菌 4.真核微生物 （ 1）土壤真菌 有 170个属， 690多个种，分三个类群 A.霉菌 土壤中最多 B.酵母菌 土壤中很少 C.伞菌 多在土壤表层 青霉菌落 霉菌菌落 烟曲霉菌的菌落 黄曲霉菌的菌落 酵母菌菌落 啤酒酵母的菌落 红酵母的菌落 酵母菌的形态 母细胞 芽细胞 酵母菌 出芽繁殖 酵母菌芽痕 一个成熟的酵母细胞一生中靠芽殖可产生 9 43个子细胞 假菌丝 真菌在土壤中的作用 是土壤有机质的主要降解者 某些真菌和植物的根系产生菌根 促进土壤结构的形成，菌丝的穿插对于促进土壤 的凝聚有重要的作用 （ 2） 藻类 藻类为单细胞或多细胞的真核原生生物。 土壤藻类主要由硅藻 、 绿藻和黄藻组成 。 肥沃土壤 ， 藻类生长旺盛 ， 土表常出现黄褐色或黄绿色的薄藻层 ， 硅藻多则是土壤营养丰富的证明 。 地衣是真菌和藻类形成的 不可分离的共生体。 地衣在土壤发生的早期起 重要作用。 （ 3） 地衣 （ Lichens） 5.非细胞型生物 病毒 病毒是一类超显微的非细胞生物，每一种病毒只有一种核酸 病毒是一种活细胞内的寄生物，凡有生物生存之处，都有其相应的病毒存在。 病毒在控制杂草及有害昆虫的生物防治方面已显示出良好的应用前景。 三、土壤微生物的分布 由于不同土壤生境的差异，导致土壤微生物分布的非均匀性。 一般来说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存。地表 5 30cm的土层中微生物数量最多；深层土壤由于有机物含量少、缺氧等原因、微生物数随土壤深度而减少，见表 8-1。 典型花园土壤不同深度每克土的微生物菌落数(cfu/g) 深度 (cm) 细菌 放线菌 真菌 藻类 3 8 9750000 2080000 119000 25000 20 25 2179000 245000 50000 5000 35 40 570000 49000 14000 500 65 75 110000 500 6000 100 135 145 1400 - 3000 - 引自 Tortora, Funke, Case, Microbiology an introduction, 7th ed. New York: Addison Wesley Longman, Inc. 2001 四、土壤中的病原微生物及其危害 土壤并非病原微生物的天然理想环境。若因各种原因造成土壤中致病菌、病毒、寄生虫卵等病原微生物增多称为土壤生物性污染。 土壤生物性污染 未经彻底无害化处理的人畜粪便和污泥用于施肥。 未经处理的生活污水、医院污水和含病原体的工业废水进行农用灌溉。 病畜尸体处理不当。 野生动物携带病原体，在迁徙和定居期间的排泄物及患病死亡后尸体，污染土壤。 造成土壤生物性污染的主要来源有： （一）土壤中的病原微生物 一些人和动物的病原菌与其他病原微生物，在条件适宜时以土壤为媒介，引起人和动物传染病的发生，即为土壤传播疾病 (soil-borne disease) 。 土壤病原微生物的种类 原生动物 土壤病原微生物 放线菌 真菌 病毒 细菌 大多数病原微生物只能在土壤中存活较短时间 。 炭疽杆菌 、 产气荚膜梭菌等 ， 形成芽孢后能在土壤中生存数年甚至几十年 。 有一些抵抗力较强的无芽孢病原菌也能生存较长时间 。 土壤一旦污染了这些病原菌 ， 则可成为疫源地 ， 随时可能使人和动物感染相应的传染病 。 影响病原微生物在土壤中存活时间 土壤有机质种类与数量 pH 温度 日照 土著微生物的拮抗 病原微生物在土壤中生存的时间 病原微生物 存活时间 粪链球菌 26 77d 沙门菌 15 280d 志贺菌 1个月 3个月 结核分枝杆菌 180d 霍乱弧菌 8 60d 鼠疫耶尔森菌 约 1年 布鲁菌 180d 土拉热费朗西丝菌 7 150d 单核细胞增生李斯特菌 18 300d 钩端螺旋体 15 43d 炭疽芽孢杆菌 15年 60年 破伤风梭菌 数年 溶组织内阿米巴 6 8d 肠道病毒 8 170d （二）病原微生物污染土壤的途径和危害 1. 人 -土壤 -人方式 2. 动物 -土壤 -人方式 3. 土壤 -人方式 病原微生物污染土壤危害人体，主要通过以下三种途径与方式： 1. 人 -土壤 -人方式 人体排出的病原微生物直接由施肥与污水灌溉等污染土壤，人直接接触土壤或生吃该土壤上种植的瓜果蔬菜而感染。 能污染土壤的肠道致病菌有沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、致病性大肠埃希菌等。 施肥与污水灌溉 污染土壤 肠道疾病、小儿麻痹症等 肠道致病菌、肠道病毒等 肠道致病菌、肠道病毒等 含病原微生物的粪便、排泄物等 2. 动物 -土壤 -人方式 钩体 钩端螺旋体病 炭疽病 有病动物排出病原微生物污染土壤，人与污染土壤直接接触而感染发病。 动物 -土壤 -人 钩端螺旋体病 传播方式 鼠、猪（储存宿主） 传染源 肾脏繁殖（隐性感染） 尿排菌 污染水源、土壤 人接触感染（皮肤、黏膜、眼结膜、垂直） 途径 病程 轻重不一 轻：类似上呼吸道感染，自限 重：黄疸、出血、休克、死亡 受损器官不同 肺出血期 流感伤寒型 黄疸出血型 肾功衰竭型 潜伏期 败血症 血管损伤期 恢复期 7 10d 1 3d 4 10d 临床表现 早 期 败血症期（ 1 3d） （轻者 3 5d自愈） 中 期 内脏损害期 （ 3 5d时出现） 后期（恢复期） 变态反应期 （病后 2周 6月内） 流感伤寒型 畏寒发热 全身酸痛 衰弱无力 结膜充血 腓肠肌痛 淋巴结肿 其他表现 肺出血型（川、陕） 黄疸出血型（广东） 脑膜脑炎型（福建） 肾 型 休 克 型 后发热 眼后发症 神经系统后发症 炭疽病 患病的动物，特别是食草动物 炭疽芽孢杆菌 皮肤炭疽的临床特点 潜伏期 1 5d。 首先出现瘙痒，接着丘疹样的损伤，进而出现水泡， 2 6d内形成凹陷的黑色焦痂。通常有中至重度、面积广泛的水肿。少有疼痛。 感染未经治疗，可扩散至局部淋巴结并入侵血流引起严重的败血症。 未经治疗的皮肤炭疽病死率在 5%至 20%之间，治疗后病死率低于 1%。 3. 土壤 -人方式 破伤风 肉毒中毒 原发性阿米巴脑膜脑炎 自然土壤中存在有致病菌，人与污染土壤接触而患病。 破伤风 一般土壤中均存在破伤风梭菌 在外界环境中形成芽孢 骨骼肌强直性与阵发性痉挛 伤口为厌氧环境，如供血受阻，伴有需氧菌感染，转变成繁殖体 释放外毒素 五、土壤微生物对环境污染物的降解 废水灌溉 (wastewater irrigation) 是将未经处理或经过一定处理后的生活或工业废水排放至土壤，灌溉农田、草地和森林，通过土壤中理化与生物作用，使废水得以净化。 农药和其他农用合成物的转化与降解 生物修复 (bioremediation) 土壤微生物的卫生学意义 参与生物地球化学物质循环和能量流 产生复杂多样的中间和终末代谢产物 土壤修复和净化 经食物、水、空气等迁移 微生物学环境质量评价 外来病原微生物的污染、条件致病微生物 第三节 土壤微生物的检测与卫生标准 一、土壤卫生微生物检测 二、土壤微生物的卫生标准 一、土壤卫生微生物检测 土壤卫生微生物检测目的在于测定土壤污染的性质和污染程度，为改善环境卫生，规划城区建设提供卫生学依据。 土壤污染特点： 1.污染物移动较慢 2.混合不均匀 3.主要集中于排放地带 样品采集 选择有代表性的采样地点，可从整个地域内随机多点取样。 土壤采样布点法 (a)对角线布点法 (b)梅花形布点法法 (c)棋盘式布点 (d)蛇形布点法 所有样混合均匀 样品分成 4等份 弃去 弃去 留用 2部份样 四分法取样步骤 样品的稀释 将土样置灭菌乳钵内研磨均匀，无菌称取 10g，加入盛有 90ml无菌自来水的广口瓶中，充分振摇混匀，静置 5 10min，取出上清液作为原液，该原液1ml含相当于土样 0.1g。取原液 1ml，加入盛有 9ml灭菌水中，混匀成 10-1稀释液，然后进一步作 10倍系列稀释。根据污染情况，采用几个稀释度进行检验。 操作步骤 称取 10g土样 振荡10min 90ml 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 20ml 20ml 20ml 倒培养基 2 检验项目与检验方法 1.菌落总数 (heterotrophic plate counts)的测定 2.大肠菌群 (coliform group bacteria)的检验 3.产气荚膜梭菌的检验 4.土壤中致病菌和病毒的检测 1.菌落总数 是指于固体培养基上，在一定条件下培养后单位重量 (g)、容积 (ml)、表面积 (m2)或体积 (m3)的被检样品所生成的细菌菌落总数。 它只反映一群在普通营养琼脂中生长的、嗜温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，常作为被检样品受污染程度的标志，用作土壤、水、空气和食品等卫生学评价的依据。 菌落总数 操作步骤： 制备土壤稀释液 接种平皿 37 培养 计数菌落 2.大肠菌群 是指一群在 37 培养 24h能分解乳糖产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 这一群细菌包括大肠杆菌属、桔椽酸菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属中的一部分，它们主要来自人和温血动物的粪便，故以此作为土壤、水和食品等受粪便污染的标志，以其含量多少来判定卫生质量。 伊红美蓝上 的大肠杆菌 大肠菌群多管乳糖发酵流程图 初发酵 复发酵 平板划线 镜检 大肠菌群值 (产气荚膜梭菌值 )是指能检出一个大肠菌群细菌 (产气荚膜梭菌 )的最小土壤量 (g)。 大肠菌群值 = 大肠菌群数1 0 0 0 检测大肠菌群可用来评价土壤是否被人或温血动物的粪便污染，并提示有无被肠道病原体污染的可能。 大肠菌群数越大，表示被粪便污染越严重；大肠菌群值越大，表示土壤越干净。 产气荚膜梭菌为芽孢菌，对外界环境抵抗力强，生存时间较长。结合大肠菌群值，可辅助判断土壤被粪便污染的时间。若发现大量产气荚膜梭菌而大肠菌群菌很少时，表示土壤非新近被粪便污染；反之，则表示新近的污染。 二、土壤微生物的卫生标准 目前我国尚未颁布土壤微生物卫生标准，下表是国外标准，仅供参考。 土壤卫生状况评价指标 卫生状况 大肠菌群值（ g） 产气荚膜梭菌值（ g） 严重污染 0.001 0.0001 中度污染 0.010.001 0.0010.0001 轻度污染 1.00.01 0.10.001 洁净 1.0 0.1 土壤卫生细菌学标准 卫生状况 大肠菌群值（ g） 产气荚膜梭菌值（ g） 硝化细菌值（ g） 嗜热菌数（ cfu/g） 严重污染 0.009 0.00009 0.0009 100001106 污染 0.90.01 0.0090.0001 0.090.001 1001105 洁净 10 0.01 0.1 100103 第四节 土壤微生物污染的预防 人畜粪便、动物尸体、污水、污泥、垃圾和医院废弃物，是土壤致病微生物污染的主要来源，在排放此类污物前，必须进行无害化处理。 无害化处理类型 化粪池或污水处理厂 沼气发酵 压缩、粉碎和分选 垃圾回收利用 堆肥 卫生填埋 焚烧 入水口 氧化池 活性污泥池 一级净化池 最终净化池 （ 三级净化池 ） 二级净化池 出水口 污水净化三级处理模式图 堆肥：粪便、有机垃圾、作物杆叶等按一定比例堆积，微生物作用分解有机物产生高温，病原体死亡，形成大量腐殖质。高温堆肥需两周，低温厌氧堆肥 1个月以上 。 德国城市家庭花园中的垃圾堆肥 高温堆肥的卫生标准 项目 卫生标准 堆肥温度 最高堆肥温度达 5055 以上，持续57d 蛔虫卵死亡率 95%100% 粪大肠菌值 10-110-2 苍蝇 有效的控制苍蝇孳生，堆肥周围没有活的蛆、蛹或新羽化的成蝇 沼气发酵：人畜粪便、垃圾、杂草、污水等放在密闭发酵池内，厌氧菌分解有机物，产生大量甲烷气（沼气）。发酵过程杀死病原菌，获得沼气（可作能源）和良好肥料。 沼气发酵的卫生标准 项目 卫生标准 密封贮存期 30d以上 高温沼气发酵温度 53 2 持续 2d 寄生虫卵沉降率 95%以上 血吸虫卵和钩虫卵 在使用粪液中不得检出活的血吸虫卵和钩虫卵 粪大肠菌值 常温沼气发酵大于 10-4，高温沼气发酵 10-110-2 蚊子、苍蝇 有效的控制蚊蝇滋生，粪池中无蚊幼虫，池的周围无活动的蛆、蛹或新羽化的成蝇 沼气池粪渣 需经无害化处理后方可用作农肥 第五节 土壤微生物研究的前景 研究微生物的分布规律 发掘丰富的菌种资源，推动进化、分类的研究和开发应用； 研究微生物与其他生物的关系 开发新的微生物农药、微生物肥料、微生态制剂； 研究微生物在自然界物质循环中的作用 探矿、冶金、治理环境污染、开发生物能源等； 研究病原微生物污染与人群健康的关系和作用规律，制定相应的防治对策和土