细胞工程与干细胞

细胞工程与干细胞,(Cell Engineering and Stem Cell ),应用细胞生物学和分子生物学技术，根据人们的意愿对细胞的遗传性状进行定向改造，以获得细胞产品、药品或医用生物材料的综合技术体系。,细胞工程,细胞工程的分类,植物细胞工程动物细胞工程微生物细胞工程,细胞整体层次： 如细胞培养、细胞融合等；细胞器层次： 如核移植、染色体倍性或组成改变等；分子层次： 如基因操作技术等。,动物细胞工程所涉及的细胞结构层次,第一节 体外细胞培养,细胞培养（cell culture） 指单个细胞或细胞群在体外条件下的培养技术，可以分为原代细胞培养和传代细胞培养。细胞系（cell line） 原代细胞经首次传代成功后的细胞 。细胞株（cell strain） 从一个经过生物学鉴定的细胞系中用单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成具有特殊性质或标志的细胞群 。,一、细胞的大规模培养,1.增加培养容积 直接向培养液中充氧。 深层全自动气升式培养缸的容量： 5升、30升、100升，1000升。,（一）增加培养容积和细胞可附着面积,目前应用较多的培养系统包括： 微载体（）、中空纤维、微胶囊固化细胞培养系统等。 微载体要求对细胞无毒性，不影响营养成分，大小适于被悬浮搅拌，可供细胞良好生长、透明无色以便观察和检查。,2.增加细胞可附着面积,细胞凋亡是导致培养器中细胞死亡的主要原因。 在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。 “细胞静止”态可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，提高目的蛋白产率。,（二）抑制细胞的凋亡,二、无血清培养,组成成分明确、质量一致、蛋白含量低；有利于提高细胞产品生产的稳定性，并使细胞产品易于纯化； 可通过对培养基成分的优化，使不同的细胞在最有利于其生长或有利于表达目的产物的环境中持续高密度培养。,（一） 无血清培养基的优点,基础培养基： Hams-F12 、DMEM、RPMI 1640等。附加成分促生长增殖成分： 转铁蛋白、硒酸钠、胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、生长激素等。促贴壁附着成分： 纤粘连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白、胶原蛋白、多聚赖氨酸 等。,（二） 无血清培养基的组成,第二节 细胞核移植,是指将一个双倍体的细胞核与另一个已将细胞核除去的卵细胞质重组在一起后，在一定条件下，能像受精卵一样启动发育并形成胚胎、幼体和成体的技术。,细胞核移植(nuclear transfer),一、技术路线,卵细胞 成熟卵母细胞(),（一）受体细胞的选取,胚胎细胞、未分化的原始生殖细胞、胎儿细胞乃至高度分化的成年动物细胞都可以作为供核细胞。,（二）供体核的获得,（三）核质融合,电融合法,重组卵需经一定时间的体外培养， 或放入中间受体动物输卵管内孵育。 家兔、猪在移植入受体子宫前约需体外培养24h。而牛、羊一般培养发育至桑椹胚期或囊胚期。,（四）重组卵的培养和植入母体,二、体细胞核移植,高度分化的成体动物细胞核仍具有发育的全能性。 当供体核处于S期时，受体细胞质中高水平的MPF使染色体出现异常的几率显著升高，而当供体核处于G1或G2期时，虽然供体核同样会出现早熟凝集染色体，但对染色体没有损害。,G2PCC 近于M期染色体，螺旋化程度低，染色浅，细 长，姐妹染色单体靠得近。,S PCC 粉末状,G1PCC 早G1期，短而粗；晚G1期，细而长。,协调供体核和去核卵母细胞的途径 1.选取处于GO或Gl期的细胞做核供体Wilmot 血清饥饿法（0.5）克隆羊 2.选取低MPF水平的卵母细胞做受体,（一）供体核和去核卵母细胞的选择,277次乳腺细胞核移植实验； 获得29个发育为8细胞的“胚”； 13头代孕母亲； 1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。,1.采用人工捕获的方法 通过限制细胞培养基中的某种成分，从而使大部分细胞滞留在细胞周期的某一阶段 。2.选择G0、G1期细胞所占比例较高的细胞类型作供核细胞 刚排出的卵母细胞周围的卵丘细胞(90以上)。,（二）获取G0或Gl期细胞的方法,Traditional crossbreeding,Recombinant DNA techniques,第三节 基因转移,选择合适的受体细胞肿瘤细胞 与正常细胞生理特性接近的细胞系要有可靠的转化后筛选方法针对细胞抗药性的筛选方法,一、物理学方法,（一）电穿孔法 采用电脉冲，简单而广泛运用于培养细胞的基因转移， 基因转移效率最高可达103。（二）显微注射法 胚胎期注入目的基因，应用范围广，转基因长度可达数百kb。（三）DNA直接注射法 最简单的基因转移方法。 如能进一步提高基因转移效率，该方法发展前景广大。,二、化学方法,（一）DEAE-葡聚糖法 对许多细胞类型的转化率极低。（二）磷酸钙共沉淀法 转化率至少是DEAE-葡聚糖法的100倍。（三）脂质体包埋法 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层包围的囊状结构。 基因转移效率很高，据报道，最高时100离体细胞可以瞬时表达外源基因。,三、生物学方法,该法主要指缺陷型病毒介导的基因转移。 目前常用的病毒载体包括DNA病毒载体（腺病毒载体、猴肿瘤病毒载体、牛瘟病毒载体）、逆转录病毒载体(转化细胞效率高)等。,外源目的基因,各种克隆载体及其可插入DNA的大小,克隆载体,可插入片段大小,质粒载体,0,10,Kb,噬菌体插入载体,0,10 Kb,噬菌体置换载体,9,23 Kb,粘粒载体,33,44 Kb,P1,噬菌体载体,70,100 Kb,PAC,载体,(噬菌体人工cs ),130,150 Kb,BAC,载体 (细菌人工cs ),300 Kb,YAC,载体,(酵母人工cs),0.2,2.0 Mb,所有的病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应； 或多或少地存在一定的安全隐患； 转导能力有限、不适于大规模生产。,病毒载体的缺点：,腺病毒为线型双链DNA病毒，无包膜，呈20面体。基因组DNA全长36kb，包装上限为37.8kb。 常用来构建载体的腺病毒是C亚属的2型（Ad2）和5型病毒（Ad5）。,A.安全性好，不整合人染色体，不导致肿瘤发生；B.宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂周期要求不严格；C.外源基因在载体上容易高效表达，病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩，且感染力不降低；,病毒载体的缺点：,一、干细胞的概念,干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。,第四节 干细胞,干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域，1999年干细胞研究被美国科学杂志评为1999年度世界十大科学之冠，2000年干细胞研究再次被科学杂志评为该年度世界十大科学成就之一。 组织工程是以干细胞研究为基础发展起来，它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题，进展极为迅速，已经成为干细胞应用的主要方向。,干细胞有几个主要特征干细胞本身不是终末分化细胞；干细胞能无限增殖分裂；干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止 状态；干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运保持为干细胞 或分化为特定细胞。,二、干细胞的分类,按分化潜能大小来分类:全能干细胞（ Totipotent stem cell ）： 它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。多能干细胞（ pluripotent stem cell ），具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞 。专能干细胞（ multipotent stem cell ），这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。,根据来源来分: 来源于胚胎- 胚胎干细胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖细胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 来源于成体- 成体组织来源的干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）,根据干细胞组织发生的名称进行分类:,胎胎干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞成骨干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞,（一）胚胎干细胞,当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞(ES cell)。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。,1.胚胎干细胞概念,人类胚胎干细胞,2.胚胎干细胞的特性,1）胚胎干细胞来源于胚胎早期的胚泡中的内细胞群，保持未分化状态，具有自我复制的能力，具有向胚胎三个胚层来源的所有细胞分化的潜能。2）胚胎干细胞可通过单细胞克隆建立有相同遗传特性的胚胎干细胞系。建立的胚胎干细胞系有与亲代细胞相同的特征 3) 胚胎干细胞具有正常、完整（双倍体）及稳定的染色体核型。,4)胚胎干细胞缺乏细胞周期中G1期的限（chechpoint），胚胎干细胞大部分时间都处于细胞周期的S期，在此期进行DNA合成。胚胎干细胞不需外源信号刺激启动DNA的复制。5）胚胎干细胞表达三种特异性标志分子：细胞内的转录因子（intrinsic transcription factor， Oct4）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）。,6）雌性哺乳动物来源的胚胎干细胞内，不存在X染色体失活现象。7）胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性，具有维持端粒长度，保持干细胞增殖能力的重要作用。 8）胚胎干细胞裸鼠皮下或肾包囊接种，可形成畸胎瘤。,3.胚胎干细胞的应用,1）基因功能的研究；2）发育机制的研究；3）药物检测；4）细胞替代疗法和组织器官移植。,（二）成体干细胞（Adult stem cell）,成体干细胞是在成体组织内具有自我更新能力并能分化产生一种或一种以上子代组织细胞的未成熟细胞。,1.成体干细胞概念,2.成体干细胞的特点,数量少，难以识别，分离纯化；体外培养时不能长时间增值；具有可塑性（神经干细胞造血干细胞）；在完全分化前经历一个中间类型即祖细胞阶段。,可塑性（plasticity）造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞等成体干细胞具有一定跨系 、甚至跨胚层分化的特性，称其为干细胞的“可塑性”。,造血干细胞间充质干细胞精原干细胞神经干细胞表皮干细胞肠干细胞肝干细胞,3.成体干细胞种类,造血干细胞（Hematopoietic stem cell，HSCs）,造血干细胞是从血液、骨髓、胶带血来源一群原始造血细胞，能自我更新、能分化成一些具有组织特化的细胞、能从骨髓中游离出来进入血液循环、能发生程序性死亡的细胞。,三个部位生产/储存造血干细胞,大部分在骨髓里，即骨髓造血干细胞。在外周血液中，即血管中有少量造血干细胞。在脐带里有丰富的造血干细胞,骨髓：1/400外周血：1/10000脐带血：1/1000,4.造血干细胞应用,造血干细胞移植可以治疗多种血液病、实体瘤、免疫缺陷和重度急性放射病，这已被多人所熟悉。基因治疗：造血干细胞以自我复制和分化潜能的特点，成为基因治疗最理想的靶细胞之一。科学家们在对造血干细胞的研究中还取得了许多新进展并发现许多新功能，研究结果表明造血干细胞具有可塑性，可以转变为血管、肝脏、脂肪、神经、肌肉等组织细胞，并深入探讨了造血干细胞治疗冠心病、神经损伤、血管闭塞性疾病等方面的新应用。,细胞工程,小结,细胞工程的概念及分类,细胞培养技术,细胞大规模培养,无血清培养,细胞核移植技术,转基因技术,物理学方法化学方法生物学方法,干细胞,干细胞概念特征,根据分化潜能,全能多能单能,根据来源,干细胞分类,胚胎干细胞成体干细胞,习 题,1. 如何实现细胞的大规模培养？2. 无血清培养与传统的培养方法相比有何 优缺点？3. 细胞核移植的技术路线是什么？4. 简述基因转移的方法有哪些？,CellNatureSc