生物技术制药

1 一 概述 1 生物药物 生物药物是指运用生物学 医学 生物化学等的研究成果 从生物体 生物组织 细胞 体液等 综合利 用物理学 化学 生物化学 生物技术和药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防 治疗和诊断的制 品 2 生物技术制药 采用现代生物技术人为地创造一些条件 借助某些微生物 植物或动物来生产所需的医药品 3 生物技术药物 采用 DNA 重组技术 单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质 治疗性抗体或核酸类药物 4 生物技术 以生命科学为基础 利用生物体 或生物组织 细胞及其组分 的特性和功能 设计构建具有预期性状的 新物种或新品系 并与工程相结合 利用这样的新物种 品系 进行加工生产 为社会提供商品和服务的 一个综合性技术体系 5 生物技术的内容 基因 细胞 酶 发酵 生化 蛋白质 抗体 糖链工程和海洋生物技术 6 生物技术的相关学科 生物学 微生物学 分子生物学 遗传学 化学 生物化学 无机 有机 分析 物理化学 工程学 化学工程 电子工程 医学 药学 农学 7 生物技术的应用 1 医药利用基因治疗人类疾病的技术取得了突破性进展 原来用于治疗单基因缺陷的遗传病的治疗技 术 现在已快速扩展到癌症 爱滋病 乙型肝炎 心血管病 此外 诊断试剂 酶试剂 动植物医药产品 核酸类药物也取得了很大进展 2 农业转基因动植物的新品种 大幅度提高产量和质量 3 食品氨基酸 天冬氨酸 半胱氨酸 有机酸 苹果酸 酒石酸 做食品添加剂 香料 葡萄糖 果糖 淀粉酶 4 工业农药 香料 饲料 工业酶 有机酶 皮革工业脱毛软化 丝绸脱胶 加酶洗衣粉 5 环境净化利用微生物或酶处理废物和废水 6 能源微生物发酵产甲烷 沼气 二 生物技术发展简史 生物技术是人类对生物资源 微生物 动植物 的利用 改造并为人类服务的技术 它的发展已有几千年 的历史 将其发展过程按技术特征可分为三个阶段 1 传统生物技术阶段出现在公元前几千年 直到 20 世纪 30 年代 主要是酿造技术 当时人们只知道酿 造技术 但不知道这些技术的内在原因 1680 年出现了显微镜 人们才知道有微生物的存在 1857 年用 实验方法证明了酒精发酵与酵母菌有关 并最终确征为酶 到此才揭开了发酵现象的奥秘 该阶段的产品 乳酸 酒精 丙酮 丁醇 柠檬酸 淀粉酶 该阶段生产的特点 过程简单 大多数属于 兼气发酵或表面培养 生产设备要求不高 产品化学结构简单 属于初级代谢产物 2 近代生物技术阶段 20 世纪 40 年代 第二次世界大战的爆发 急需疗效好 毒副作用小的抗细菌感染 药物 出现了青霉素 产量低 产品价格昂贵 随着发酵新技术的出现 又相继发现了链霉素 红霉素 金霉素等药物 该阶段的主要产品 抗生素 维生素 甾体 氨基酸 食品工业的工业酶制剂 食用氨 基酸 酵母 啤酒 化工业的酒精 丙酮 丁醇 沼气 农林业的农药 环境保护业的生物治理污染 该阶段生物技术的特点 1 产品类型多 初级 氨基酸 酶 有机酸 次级 抗生素 生物转化 甾体 2 生物技术要 2 求高 纯种 无菌 通气 产品质量要求也高 3 生产设备规模大 500 立方米 2000 立方米 4 技术发展速度快 青霉素 200 单位每毫升 8 万单位每毫升 形成了交叉学科生化工程 3 现代生物技术 标志 1953 年美国 Watson 和英国的 Crick 共同提出了 DNA 的双螺旋结构 揭开了生命科学划时代的一页 此后 又相继出现了一系列新发现和新进展 遗传中心法则 破译遗传密码 基因重组 单克隆抗体 DNA 测序 产品见表 1 1 动植物细胞培养技术 该阶段产品种类很多 胰岛素 干扰素 生长激素等 该阶段生物技术的内容包括 1 重组 DNA 技术及其它转基因技术 2 细胞和原生质体融合技术 3 酶或细胞的固定化技术 4 植物脱毒和快速繁殖技术 5 动物细胞大量培养技术 6 动物胚胎工程技术 7 现代发酵技术 高密度发酵 连续发酵 新 型发酵技术 8 现代生物反应工程和分离工程技术 9 蛋白质工程技术 10 海洋生物技术 三 医药生物技术新进展 近 10 年是生物技术迅速发展的时期 主要有四个方面的进展 1 基础研究不断深入 重组 DNA 新基因的克隆和基因表达调控的研究全面展开 分子生物学理论和技术两大体系已基本完成 生物学中的中心法则所体现的遗传信息的转移规律奠定了遗传工程的理论基础 有关基因表达的各种研究 结果又丰富和发展了中心法则 DNA 测序 为对付不治之症提供了可能性 人类基因组计划的研究目标就是要定位所有的基因和测定它们的核苷酸序列 人类基因组大约有 10 万个 基因 30 亿个核苷酸对 完成这项研究是一项空前浩大的工程 它的实施对人类了解自身和医学发展有划 时代的意义 与疾病相关的基因有约 5000 个 一些重要的遗传病基因已被分离并测序 3 新产品不断出现 自 20 世纪 80 年代以来 仅美国 日本开发的生物新技术新药物便达 200 多种 大都是重组蛋白质药物和 重组 DNA 药物 世界范围内 销路最好的生物技术药物 临床应用时间比较长 疗效比较好 毒副作用比较小 干扰素 抗病毒 抗癌 有种属特异性 动物干扰素对人无效 最初收集大量血液 提取白血球再与诱导物作用来 生产 现在用基因重组技术把干扰素基因插入大肠杆菌来生产 白介素与机体免疫功能有关 白介素 2 促 进淋巴细胞分化增殖 乙型肝炎疫苗 预防乙肝 集落刺激因子 可减轻化疗时副作用 可用于爱滋病 白血病 肿瘤坏死因子 可损伤癌细胞 研制更新一代的药物和更新的应用方法 集落刺激因子和白介素 的基因构建到酵母细胞中 使之产生融合蛋白质 药效增强 生产方法从利用重组 DNA 的微生物生产转向 利用动植物来生产蛋白质类药物 构建新型多价活疫苗 3 新试剂 新技术不断出现 细胞工程及基因工程的应用产生了新的医疗技术 细胞移植和基因治疗 细胞移植用于骨髓移植 治疗白 血病 淋巴病 免疫缺陷 再生障碍性贫血及放疗 化疗后的肿瘤病人 基因治疗目前仍在实验阶段 可 用于遗传病 癌症 爱滋病的治疗 心脏内直接注入外来基因 两三周长出新血管 关键点是如何将有用 基因引入靶组织中 并使之在合适的地方 合适的时间表达合适量的活性多肽或蛋白质 生物试剂的开发 单克隆抗体 专一性强 由鼠源性转向人源性 应用 基础研究 诊断 体内显像定位 食品和环境检测 体内治疗和导向治疗 工业上利用单抗进行亲和层析高效纯化天然基因工程基因 单抗 可与放射性核素 酶 荧光素标记技术相结合 用于检测和治疗 病毒 细菌 寄生虫和某些肿瘤的诊断 免疫学 激素 酶和环境污染因子的检测 显像定位 单抗与抗癌药物偶合后 减少副作用 加大药量 4 新型生物反应器和新分离技术不断出现 3 传统 搅拌式生物反应器 改进 塑料袋 填充床 气升式 流化床 固定床 袋式 膜式 中空纤维 固定化培养 搅拌形状改进 浆式 棒式 船帆式 笼式通气 1000 升 四 我国的医药生物技术 我国起步晚 20 世纪 80 年代初 把生物技术定为科技和产业发展的重要新领域之一 85 年制定了生物技 术发展政策 89 年制定了 90 2000 年和 2020 年发展纲要 20 世纪 70 年代 起步时是固定化酶的研究 固定化细胞 80 年代初期 开发研究乙型肝炎基因工程疫苗 基因工程干扰素 国内投入大量资金建立 30 个生物技术领域国家重点实验室 可生产活性多肽类药物 干扰素 白介素 心钠素等多种生物药物 五 医药生物技术发展展望 20 世纪生物技术是科研阶段 产业初期 21 世纪将进入大规模产业化 研究成果转变成产品 三大类药物 生物 化学 中药 发展比较迅速的医药生物技术有四个领域 1 利用新发现的人类基因 开发新型药剂 完成人类基因组计划会发现许多新基因 而且很多与疾病有关或直接参与疾病的形成 找到了目的基因 也就是需要修复的基因可以帮助我们利用基因工程来寻找新药或基因治疗的方法 21 世纪 50 70 的新药 来自基因工程的研究 2 新型疫苗的研制 疫苗在许多疾病的预防 治疗中起着其他药物无法代替的作用 现在正在进行爱滋病及 20 多种基因型癌 症疫苗的研制 用于防治癌症 爱滋病 关节炎 贫血 骨质疏松 百日咳 乙肝等疾病 3 基因工程活性肽 淋巴因子 生长因子 激素 酶 都属于活性多肽 由两条以上肽链组成 很强的生物活性 常以微量存在于人体 基因工程方法生产 应用 1 在体外和离体研究中作为细胞培养补充剂 2 基础研究对象 3 作为研究其他现象 免疫 的一 种辅助剂 4 诊断剂 5 生物治疗的研究开发 脑啡肽 胃肠肽 4 其他 疾病早期诊断 PCR 单克隆抗体 转基因材料 外源基因在植物中表达 脑啡肽 干扰素 生长激素 转 血红蛋白基因的烟草植物生产人造血浆 一 生物药物的来源 1 生物药物的定义 生物药物是指运用生物学 医学 生物化学等的研究成果 从生物体 生物组织 细胞 体液等 综合利 用物理学 化学 生物化学 生物技术和药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防 治疗和诊断的制 品 2 生物药物的原料来源 天然的生物材料 人体 动植物 微生物和各种海洋生物 随着生物技术的发展 有目的人工制得的生物原料成为当前生物制药原料的重要来源 如用基因工程技术 制得的微生物或细胞 生物药物原料的选择 预处理与保存方法 1 原料选择原则 有效成分含量高 原料新鲜 来源丰富 易得 产地较近 原料中杂质含量少 成 本低 2 预处理与保存 预处理 就地采集后去除结缔组织 脂肪组织等不用的成分 将有用成分保鲜 处理 收集微生物原料时 要及时将菌体与培养液分开 进行保鲜处理 4 保存方法 冷冻法 适用于所有生物原料 40 有机溶剂脱水法 丙酮 适用于原料少 价值高 有机 溶剂对原料生物活性无影响 防腐剂保鲜 常用乙醇 苯酚等 适用于液体原料 如发酵液 提取液 二 生物药物的特性 1 药理学特性 1 治疗的针对性强 细胞色素 c 用于治疗组织缺氧所引起的一系列疾病 2 药理活性高 注射用的纯 ATP 可以直接供给机体能量 3 毒副作用小 营养价值高 蛋白质 核酸 糖类 脂类等生物药物本身就直接取自体内 4 生理副作用时有发生 生物体之间的种属差异或同种生物体之间的个体差异都很大 所以用药时会 发生免疫反应和过敏反应 2 生产 制备中的特殊性 1 原料中的有效物质含量低 激素 酶在体内含量极低 2 稳定性差 生物药物的分子结构中具有特定的活性部位 该部位有严格的空间结构 一旦结构破坏 生物活性也就随着消失 酶 很多理化因素使其失活 3 易腐败 生物药物营养价值高 易染菌 腐败 生产过程中应低温 无菌 4 注射用药有特殊要求 生物药物易被肠道中的酶所分解所以多采用注射给药 注射药比口服药要求 更严格 均一性 安全性 稳定性 有效性 理化性质 检验方法 剂型 剂量 处方 储存方式 3 检验上的特殊性 由于生物药物具有生理功能 因此生物药物不仅要有理化检验指标 更要有生物活性检验指标 第一节 概述 生物技术的核心是基因工程 基因工程技术最成功的成就是用于生物治疗的新型生物药物的研制 之前 许多在疾病诊断 治疗和预防中有重要价值的内源性生理活性物质 激素 细胞因子 神经多肽 调节蛋 白 酶类 凝血因子等 以及某些疫苗 由于材料来源困难或制造技术问题而无法研制出产品 即使应用 传统技术从动物器官中提取出来 也因为造价太高而使患者负担不起 而应用基因工程技术就可以从根本 上解决上述问题 它的应用使人们在解决癌症 心血管疾病和内分泌疾病等方面中取得明显效果 它为上 述疾病的预防 治疗和诊断提供了新型疫苗 新型药物和新型诊断试剂 利用基因工程生产的药物主要是医用活性蛋白和多肽 免疫性蛋白 各种抗原和单克隆抗体 细胞因子 干扰素 白介素 生长因子 激素 胰岛素 生长激素 酶类 尿激酶 链激酶超氧化物歧化酶 利用基因工程技术生产药物的优点 1 大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽 为临床使用提供 有效的保障 2 可以提供足够数量的生理活性物质 以便对其生理 生化和结构进行深入的研究 从而 扩大这些物质的应用范围 3 可以发现 挖掘更多的内源性生理活性物质 4 内源生理活性物质在作为 药物使用时存在的不足之处 可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除 5 可获得新型化合物 扩 大药物筛选来源 第二节 基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体 拼接后转入新的宿主细胞 构建成工程菌 实现遗传 物质的重新组合 并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术 基因工程药物制造的主要程序是 目的基因的克隆 构建 DNA 重组体 将 DNA 重组体转入宿主菌构建工 程菌 工程菌的发酵 外源基因表达产物的分离纯化 产品的检验等 通常将基因工程药物的生产分为上游和下游技术 上游阶段是研究开发必不可少的基础 它主要是分离目 的基因 构建工程菌 主要在实验室完成 下游阶段是从工程菌的大规模培养到产品的分离纯化 质量控 制 该阶段是将实验室成果产业化 商品化 制备基因工程药物的一般程序 获得目的基因 组建重组质粒 构建基因工程菌 5 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装 基因的表达系统有原核生物系统和真核生物生物系统 选择表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功 能 其次是表达量的多少和分离纯化的难易 下游下工技术主要包括工程菌大规模培养最佳参数的确定 新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置 的开发 分离纯化的优化控制 高纯度产品的制备技术 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造 电 子计算机的优化控制等 第三节 目的基因的获得 对于原核生物 其基因总量不大 可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因 而对于真核生物不能 进行直接分离 真核细胞中基因总量较大 从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难 另外 真核基因 一般都有内含子 如果以原核细胞作为表达系统 即使分离出真核基因 由于原核细胞缺乏 mRNA 转录后 的加工系统 真核基因转录的 mRNA 也不能被加工 拼接成为成熟的 mRNA 因此不能直接克隆真核基 因 克隆真核基因常用的方法有逆转录法和和学合成法 一 逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA 再反转录成互补 DNA 然后进行互补 DNA 的克隆表达 从产 生该蛋白质的真核细胞中提取 mRNA 以其为模板 在逆转录酶的作用下 反转录合成该蛋白质 mRNA 的 互补 DNA 再以互补 DNA 为模板 在逆转录酶或 DNA 聚合酶作用下 最终合成编码该蛋白质的双链 DNA 序列 该序列不含内含子 1 mRNA 的纯化 细胞内含有三种 RNA mRNA 占 RNA 总量的 2 5 相对分子量大小不一致 分离也有很大的困难 但是 mRNA 的 3 末端常含有一多聚腺苷酸组成的末端 长达 20 250 个腺苷酸 足以吸附于寡聚胸苷酸 纤维素 上 从而可以用亲和层析法将 mRNA 从细胞总 RNA 上分离出来 可得到纯度较高的 mRNA 2 互补 DNA 第一链的合成 mRNA 的 3 末端常含有一多聚腺苷酸序列 可用寡聚脱氧胸苷酸为引物 在逆转录酶的催化下 开始互 补 DNA 的合成 在合成反应体系中加入一种放射性标记的 dNTP 在反应中以及反应后可通过测定放射性 标记的 dNTP 掺入量 计算出互补 DNA 的合成效率 在凝胶电泳后 进行放射自显影分析产物的分子大小 探索最佳反应条件 3 互补 DNA 第二条链的合成 先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补 DNA mRNA 杂交链中的 mRNA 链 然后以互补 DNA 第一链为模板 合成第二链 并用核酸酶 S1 专一性切除单链 DNA 4 互补 DNA 克隆 载体有两种质粒和噬菌体 根据重组后插入的互补 DNA 是否能够表达 能否经转录和翻译 合成蛋白质 又将载体分为表达型载体和非表达型载体 互补 DNA 插入片段小于 10 千碱基对 可选用质粒载体 如大 于 10 千碱基对则选用噬菌体作为载体 二 化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成法合成 其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列 或已知蛋白质的氨基酸序列 按相应的密码子推导出 DNA 的碱基序列 用化学方法合成目的基因不同部位 的两条链的寡核苷酸短片段 再退火成为两端形成粘末端的 DNA 双链片段 然后将这些双链片段按正确的 次序进行退火使连接成较长的 DNA 片段 再用连接酶连接成完整的基因 人工化学合成的限制 1 不能合成太长的基因 50 60 个碱基对 2 人工合成碱基对时 遗传密码的简 并会为选择密码子带来很大的困难 3 费用较高 第四节 基因表达 基因表达是指结构基因在生物体中的转录 翻译以及所有加工过程 进行基因表达 我们所关心的是目的 基因的表达产量 表达产物的稳定性 产物的生物学活性和表达产物的分离纯化 6 一 宿主细胞的选择 宿主细胞应满足以下要求 1 容易获得较高浓度的细胞 2 能利用廉价易得的原料 3 不致病 不产 生内毒素 4 发热量低 需氧低 适当的发酵温度和细胞形态 5 容易进行代谢调控 6 容易进行 DNA 重组技术操作 7 产物的产量 产率高 产物容易提取 宿主细胞的种类及特点 宿主可分为两大类 原核细胞 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 链霉菌 真核细胞 酵母菌 丝状真菌 哺乳动物细胞 1 原核细胞 1 大肠杆菌 生长迅速 对其研究比较深入 所以常用 特点 表达基因工程产物的形式多种多样 有细胞内不溶性表 达 包含体 胞内可溶性表达 细胞周质表达等 极少数还可以分泌到细胞外表达 限制 没有信号肽 所以产品多为细胞内产物 提取时需破碎细胞 这样细胞质内其他蛋白质也释放出来 造成提取困难 由于分泌力不足 真核蛋白质常形成不溶性的包含体 表达产物必须在下游处理过程中经 过变性和复性处理才能恢复其生物活性 2 枯草芽孢杆菌 分泌能力强可将蛋白质产物直接分泌到培养液中 不形成包含体 但该菌也不能使蛋白质产物糖基化 另 外由于它有很强的胞外蛋白酶 会对产物进行降解 3 链霉菌 主要特点 不致病 使用安全 分泌能力强 可将表达产物直接分泌到培养液中 具有糖基化能力 2 真核细胞 1 酵母 特点 是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物 基因组小 仅为大肠杆菌的 4 倍 世代时间短 有单倍体 双倍体两种形式 繁殖迅速 可以廉价地大规模培养 没有毒性 能将表达产物直接分泌到胞 外 表达产物能糖基化 2 丝状真菌 特点 有很强的蛋白质分泌能力 能正确进行翻译后加工 而且糖基化方式与高等真核生物相似 3 哺乳动物细胞 特点 产物可分泌到胞外 细胞培养液成分完全可控制 使产物纯化较容易 表达产物能糖基化 接近或 类似与天然产物 动物细胞生产慢 生产率低 培养条件苛刻 费用高 培养液浓度较稀 综上所述 目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母 因为对它们的遗传背景研究得比较清楚 建立了许多适合于它们的克隆载体和 DNA 导入方式 并且许多外源在这两种宿主菌中得到表达成功 二 大肠杆菌中的基因表达 1 载体 根据真核基因在原核细胞中表达的特点 表达载体应具备下列条件 1 载体能够独立复制 有复制起 点 有严紧型和松弛型 严紧型伴随宿主染色体的复制而复制 在宿主细胞中拷贝少 1 3 松弛型的复 制可不依赖与宿主细胞 在宿主细胞中拷贝多达 3000 个 2 应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 利于外源基因的克隆 鉴定和筛选 3 应具有很强的启动子 能为达成杆菌的 RNA 聚合酶所识别 4 应具有阻遏子 使启动子受到控制 只有当诱导时才能进行转录 5 应具有很强的终止子 以便使 RNA 聚合酶集中力量转录克隆的外源基因 而不转录其他无关的基因 同时很强的终止子所产生的 mRNA 较为稳定 6 所产生的 mRNA 必须有翻译的其始信号 2 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因在宿主中的表达受许多因素影响的 所以在建立表达体系时要综合考虑各种因素的作用 建立一 个合适的表达体系 从而使外源基因得到最大的表达量 获得最多的表达产物 7 1 外源基因的拷贝数 外源基因是克隆到载体上的 所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因的表达相关 应将外源基因克 隆到高拷贝的质粒载体上 这对于提高外源基因的总体表达水平非常有利 2 外源基因的表达效率 启动子的强度 在转录水平上直接影响基因的表达 核糖体结合位点的有效性 SD 序列和起始 ATG 的间 距 密码子的组成等都会不同程度地影响外源基因的表达 3 表达产物的稳定性 表达的外源基因 其产物会受到宿主细胞内降解该蛋白质的酶的作用 使得实际产量很低 可采用下列方 法来提高表达产物的稳定性 组建融合基因 产生融合蛋白 利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自 身的信号肽 把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中 而使外源蛋白不易被酶降解 采用位点特异性突 变的方法 改变真核蛋白二硫键的位置 从而增加蛋白质的稳定性 选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细 胞 4 细胞的代谢负荷 外源基因在宿主细胞内的大量表达 必然会影响宿主细胞正常的生长代谢 有些产物对宿主还会有毒害作 用 将细胞杀死 为了减轻宿主细胞的代谢负荷 同时还得提高外源基因的表达水平 可以采取当宿主细 胞大量生长时 抑制外源基因的表达 即将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段 使表达产物不会 影响细胞的正常生长 当宿主细胞的生物量达到饱和时 再进行基因产物的诱导合成 以减低宿主细胞的 代谢负荷 另外 将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开 当宿主细胞迅速生长时 抑制重组质粒的复 制 当细胞生长量累积到一定水平后 再诱导细胞中重组质粒的复制 增加质粒拷贝数 5 工程菌的培养条件 优化培养条件使外源基因大量表达 3 真核基因在大肠杆菌中的表达形式 三种 融合蛋白 非融合蛋白 分泌型 1 融合蛋白 融合蛋白的氨基端是原核序列 羧基端是真核序列 这样的蛋白质是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合 在一起的 优点 基因操作简便 蛋白质在菌体内比较稳定 不易被细菌酶类所降解 容易实现高效表达 缺点 只能做抗原作用 原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原性 可再切割成两个多肽链 2 非融合蛋白 表达非融合蛋白的操纵子必须改建成 细菌或噬菌体的启动子 细菌的核糖体结合位点 真核基因的起始 密码子 结构基因 终止密码 要求核糖体结合位点序列与翻译起始密码之间的距离要合适 稍有不适就 会影响表达效率 优点 能够较好地保持原来的蛋白活性 缺点 容易被蛋白酶破坏 氨基末端常常带有甲硫氨酸 在人体内用药时可能会引起人体免疫反应 3 分泌型 将外源基因接到信号肽之后 使之在胞质内有效地转录和翻译 当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜 之间的周质后时 被信号肽酶识别切割 从而释放出有生物活性的外源基因表达产物 特点 一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中是稳定的 由于有些蛋白质能按一定的方式折叠 所以在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性 蛋白质信号肽和编码序列之间能被切割 因 而分泌后的蛋白质产物不含起始密码所编码的甲硫氨酸 产量不高 信号肽不被切割或不在特定位置上切 割 三 酵母中的基因表达 1 载体 酵母载体是可以携带外源基因在在酵母细胞内保存和复制 并随酵母分裂传递到子代细胞的 DNA 或 RNA 8 单位 从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多 因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的 只有在最后阶段在转入酵母中 酵母载体有两类 普通表达载体和精确表达载体 普通表达载体 只能方便地引入外源基因并进行表达 对表达产物的组成 特别是对其氮末端氨基酸是否 有增减并无严格要求 精确表达载体 要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点 以利于接入外源基因 并使它 在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同 既无多余的氨基酸 也无缺失的氨基酸 2 影响目的基因在酵母菌中表达的因素 1 外源基因的拷贝数 拷贝数要适当 高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达 但会引起细胞生长量的降低 单拷贝的质粒 载体对细胞的最大生长没有影响 能达到较高效的表达 2 外源基因的表达效率 与启动子 分泌信号 终止序列有关 要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆到酵母军表达载体 的启动子和终止子之间 构成表达框架 分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列 它帮助后 面的表达产物分泌出酵母细胞 并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键 产 生正确的表达产物 终止序列保证了转录产物在适当的部位终止和加上多聚腺苷酸尾巴 这样形成的 mRNA 可能比较稳定并被有效地翻译 3 外源蛋白的糖基化 外源蛋白在分泌过程中发生糖基化 4 宿主菌株的影响 宿主菌株应具备下列要求 菌体生长力强 菌体内源蛋白酶要较弱 菌体性能稳定 分泌能力强 四 动物细胞中的基因表达 动物细胞表达的特点 产物可分泌到细胞外 培养液成分可人工调控 产物纯化比较容易 产物是糖基化 的 接近或类似于天然产物 但动物细胞生长慢 单位体积生产率低 培养条件苛刻 费用高 培养液浓 度较小 第五节 基因工程菌的稳定性 基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象 有分裂不稳定和结构不稳定 分裂不稳定是指工程 菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象 质粒结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排 缺失所致工程菌性能的改变 一 质粒不稳定产生的原因 常见的是分裂不稳定 与两个因素有关 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率 这两种菌的比生长速率差 异的大小 含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大 增加工程菌中的质粒拷贝数能提高质 粒的稳定性 含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低 但是大量外源质粒的存在使含质粒 菌的生长速率明显低于不含质粒菌 而不含质粒菌一旦产生 能较快地取代含质粒菌而成为优势菌 因而 对这类菌进一步提高质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势 质粒稳定性的分析方法 将工程菌培养液样品适当稀释 均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基上 培养 10 12 小时 然后随机挑出 100 个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板上 培养 10 12 小时 统计长 出的菌落数 每一样品应取 3 次重复的结果 计算出比值 该比值反映了质粒的稳定性 二 提高质粒稳定性的方法 采用两阶段法 第一阶段先使菌体生长至一定密度 第二阶段诱导外源基因的表达 在培养基中加入选择 性压力如抗生素等 以抑制质粒丢失菌的生长 适当的操作方式也可使工程菌生长速率具有优势 调控温 度 pH 培养基组分 溶解氧 通过间歇供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性 第七节 基因工程菌发酵 9 基因工程菌的培养过程主要包括 1 通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件 分析表达产物的合成 积累对受体细胞的影响 2 通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序 一 基因工程菌的培养方式 1 补料分批培养 将种子接入反应器中后 培养一段时间 然后间歇或连续补加新鲜培养基 使菌体进一步生长 为保持基 因工程菌生长所需的良好环境 延长对数生长期 获得高密度菌体 通常把溶氧控制和补料措施结合起来 根据生长规律来调节补料速率 2 连续培养 将种子接入反应器后 培养一段时间 到一定菌浓 开动蠕动泵 同时进料和出料 控制一定稀释速率 由于基因工程菌不稳定 可将生长阶段和基因表达阶段分开 进行两阶段连续培养 关键的控制参数是诱 导水平 稀释率 细胞比生长速率 3 透析培养 利用膜的半透性使代谢产物和培养基分离 通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响 4 固定化培养 基因工程菌固定化后 质粒的稳定性大大提高 便于进行连续培养 特别是对于分泌型菌更为有利 二 基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌培养目的是为了使外源基因大量表达 尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染 外源基因的高效 表达 不仅涉及宿主 载体和克隆基因之间的相互关系 而且也其所处的环境也密切相关 不同的发酵条 件 代谢途径也不相同 对下游的纯化工艺就会造成不同的影响 1 培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率 又要保持重组质粒的稳定性 使外源基因能够高效表达 使用不同的碳源对菌体生长和外源基因的表达有较大的影响 如葡萄糖做碳源菌体产生的副产物较多 甘 油做碳源菌体得率较大 酪蛋白水解物做氮源有利于产物的合成与分泌 无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子 在低磷浓度下 尽管最大菌浓较低 但产物产率和 产物浓度都较高 启动子只有在低磷酸盐时才被启动 2 接种量的影响 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期 量小 延长菌体延迟期 不利于外源基因的表达 量大 有利 于对基质的利用 可以缩短生长延迟期 并使产生菌能迅速占领整个培养环境 减少污染机会 但会使菌 体生长过快 代谢产物累积过多 反而会抑制后期菌体的生长 3 温度的影响 温度对基因表达的调控作用可发生在复制 转录 翻译或小分子调节分子的合成上 复制 可通过控制复 制来改变基因拷贝数 影响基因的表达 转录 可通过影响 RNA 聚合酶的作用或修饰 RNA 聚合酶 来调 控基因表达 酶促反应 4 溶解氧的影响 菌体在大量扩增过程中 进行耗氧的氧化分解代谢 采用调节搅拌转速的方法可以改善培养过程中的氧供 给 提高活菌产量 在发酵前期采用较低转速 即可满足菌体生长 在培养后期 提高搅拌转速才能满足 菌体继续生长的要求 这样既节约能源又可满足各个不同阶段菌体生长的要求 5 诱导时机的影响 一般在对数生长期或对数生长期后期升温诱导表达 对数生长期 细胞快速繁殖 直到细胞密度达到 109 个每毫升为止 这时菌群数目倍增 对营养和氧的需求量急增 营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素 6 pH 的影响 两阶段培养工艺 培养前期着重于优化工程菌的最佳生长条件 培养后期着重于优化外源基因的表达 生 长最佳期 pH6 8 7 4 外源蛋白表达时 pH 6 0 6 5 10 第九节 基因工程药物的质量控制 基因工程药物的特点 用活细胞作为表达体系 所获得的蛋白质产品往往相对分子量较大 并有复杂的结 构 许多药物是参与一些生理功能精密调节所必需的蛋白质 所以任何药物在性质或剂量上的偏差 都可 能造成严重的后果 从原料开始每一步都要进行严格的控制 一 原料的质量控制 原料的质量控制是为了保证编码药品的 DNA 序列的正确性 以及产品质量的安全性和一致性 根据质量控制的要求 应了解下列特征 目的基因的来源 克隆的经过 并用限制性内切酶酶切图谱和核 苷酸序列等予以确证 应提供表达载体的名称 结构 遗传特性及其各组分 复制子 启动子 的来源与 功能 构建中所用位点的酶切图谱 抗生素抗性标志物 提供宿主细胞的名称 来源 传代历史 检定结 果及其生物学特性 需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态 如是否整合到染色体上 及在其中的拷贝数 并证明宿主细胞与载体结合后遗传稳定性 提供插入基因与表达载体俩侧端控制区内 的核苷酸序列 详细叙述在生产过程中 启动与控制克隆基因在宿主细胞表达的方法与水平等 二 培养过程的质量控制 储存中 要求种子克隆纯而稳定 培养中 工程菌所含的质粒稳定 始终无突变 在重复生产发酵中 表 达稳定 始终能排除外源微生物的污染 生产基因工程产品应有种子批系统 并证明种子批不含致癌因子 无细菌 病毒 真菌和支原体等污染 并由原始种子批建立生产用工作细胞库 原始种子批需确证克隆基因 DNA 序列 详细叙述种子批来源 方 式 保存以预计使用期 保存与复苏的方法和材料 并控制微生物污染 提供培养生产浓度与产量恒定性 数据 依据宿主细胞 载体系统稳定性 确定在高允许传代数 培养过程中 应测定被表达基因分子的完整 性及宿主细胞长期培养后的基因型特征 依宿主细胞 载体稳定性与产品恒定性 规定持续培养时间 并定 期评价细胞系统和产品 三 纯化工艺过程的质量控制 要有足够的生理和生物学试验数据 确证提纯分子批间保持一致性 外源蛋白质 DNA 与热源质都在规定 的限度以下 在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质 核酸 糖类 病毒 培养基成分及精制工序本身引入的化学物质 四 目标产品的质量控制 药物质量控制包括以下要求 产品的鉴别 纯度 活性 安全性 稳定性 一致性 利用多学科的技术生 物化学 免疫学 微生物学 细胞生物学和分子生物学 1 产品的鉴别 肽图分析 用酶法和化学方法降解目的蛋白 对生成的肽段进行分离分析 检测蛋白质一级结构中细微变 化的最有效方法 灵敏 高效 高效液相色谱和毛细管电泳 氨基酸成分分析 小于 50 个氨基酸分析结果较可靠 部分氨基酸序列分析 氨基端 15 个氨基酸 重组蛋白质的浓度测定和相对分子量测定 浓度 凯氏定氮法 双缩脲法 染料结合比色法 福林 酚法和 紫外光谱法 分子量 凝胶过滤法 完整 和 SDS PAGE 法 亚基 蛋白质二硫键分析 维持蛋白质一级结构的重要共价键 2 纯度分析 包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析 1 目的蛋白 根据理化性质和生物学特性 常用还原性及非还原性 SDS PAGE 等电聚焦 各种高效液 相 毛细管电泳等 应用两种以上方法 2 杂质 包括蛋白质和非蛋白质杂质 蛋白类 宿主细胞蛋白 采用免疫方法和电泳相结合 非蛋白 类 病毒 细菌等微生物 热源质 内毒素 致敏原及 DNA 利用微生物学方法检测无菌 热源质检测用 家兔注射 3 生物活性测定 11 需要动物体内实验和通过细胞培养进行体外效价测定 重组蛋白质是一种抗原 可用放射免疫分析法或酶 标法测定其免疫学活性 体内生物学活性的测定要根据目的产物的生物学特性建立适合的生物学模型 体 外生物活性测定有细胞计数法等 4 稳定性考察 是评价药品要效性按安全性的重要指标 也是确定药品储藏条件和使用期限的主要依据 对温度 氧化 光照 离子浓度和机械剪切等环境因素都很敏感 5 产品一致性的保证 生产周期长 影响因素多 必须对每一步都进行严格的控制 五 产品的保存 目的产物受多种因素的影响而失活 保存时要防止变性 降解 保护活性中心 1 液态保存 低温保存 对热敏感 在稳定 pH 条件下保存 防止变性 高浓度保存 高浓度时比较稳定 加保护剂保存 糖类 脂肪类 蛋白质类 多元醇 有机溶剂等 有些需要加盐 加 2 巯基乙醇在真空或 惰性气体中保存 2 固体保存 固体蛋白质比液体稳定 在室温或冰箱中保存比较稳定 长期保存最好制成干粉或结晶 六 基因工程在抗生素生产中的应用 1 提高抗生素产量 工业使用的抗生素产生菌都是通过物理或化学方法诱变后得到的 如果利用基因工程技术有目的地定向改 造基因 提高基因的表达水平以改造菌种的生产能力效果会更好 可进行以下几方面的工作 1 将产生菌基因随即克隆到原株直接筛选高产菌 在克隆菌株中 增加某一与产量有关的基因剂量 使产量得到提高 2 增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数 抗生素生物合成途径中的某个阶段可能是整个合成中的限速阶段 识别位于合成途径中的限速瓶颈 并设 法导入能提高这个阶段酶系的基因拷贝数 如果增加的中间产物不对合成途径中某个步骤产生反馈抑制 就有可能增加最终抗生素的产量 3 通过调节基因的作用 调节基因的作用可增加或降低抗生素的产量 正调节基因可能通过一些正调控机制对结构基因进行正向调 节 加速抗生素的产生 负调节基因可能通过一些负调控机制对结构基因进行负向调节 降低抗生素的产 量 因此 增加正调节基因或降低副调节基因的作用 可增加抗生素的产量 4 增加抗性基因 抗性基因可通过其产物灭活胞内或胞外的抗生素 保护自身免受所产生的抗生素的杀灭作用 有些抗性基 因的产物还直接参与抗生素的合成 抗性基因经常和生物合成基因连锁 而且它们的转录有可能也是紧密 相连的 是激活生物合成基因进行转录的必须成分 抗性基因必须首先进行转录 建立抗性后 生物合成 基因的转录才能进行 抗生素的产生与菌种对其自身抗生素的抗性密切相关 抗生素的生产水平是由抗生 素生物合成酶和对自身抗性的酶所共同确定 这就为通过提高菌种自身抗性水平来改良菌种 提高抗生素 产量提供了依据 2 改善抗生素组分 许多抗生素产生菌可产生多组分抗生素 由于这些组分的化学结构和性质非常相似 而其生物活性有时却 相差很大 这给有效组分的发酵 提取和 精制带来了很大不便 随着对抗生素生物合成途径和深入了解 及基因重组技术的不断发展 应用基因工程技术可以定向地改造抗生素产生菌 获得只产生有效组分的菌 种 12 3 改进抗生素生产工艺 抗生素的合成一般对氧的供应较为敏感 不能大量供氧往往是高产发酵的限制因素 为了使细胞处于有氧 呼吸状态 传统方法是 改变最适操作条件 降低细胞生长速率 培养密度 提高供氧水平只能从设备和 操作角度考虑 提高溶氧水平或气液传质系数 提高发酵罐中无菌空气的通入量 并采用各种搅拌装置 使空气分散 满足菌体生长的要求 空气的压缩 冷却或过滤 搅拌都要消耗大量的能源 结果并不理想 进入液相的氧分子需要穿过几层膜才能到达菌体 进入菌体后 还要经物理扩散才能到达产生能量的呼吸 细胞器 如在菌体内导入与氧有亲和力的血红蛋白 呼吸细胞就能容易的获得足够的氧 降低细胞对氧的 敏感程度 利用它改善发酵过程中溶氧的控制程度 利用基因重组技术克隆血红蛋白基因到抗生素产生菌 中 在细胞中表达血红蛋白 可以从提高细胞自身代谢功能入手解决溶氧供求矛盾 4 产生杂合抗生素 不同抗生素合成基因重组 生物合成途径中某个酶基因的突变 在生物合成途径中引入一个酶基因 利用 底物特异性不强的酶催化形成新产物 基因工程抗体的类型有 1 人 鼠嵌合抗体 2 改形抗体 3 小分子抗体 4 双功能抗体 5 抗体融合蛋白 第二节 动物细胞的形态和生理特点 一 动物细胞的形态 动物细胞属于真核细胞 结构复杂 分化精确 不同细胞执行不同的功能 例如神经细胞具有很长的分支 很多的纤维 以便接受和传递刺激 红细胞呈扁圆盘状 增大其接触面等 但细胞在离体培养时形态会发 生变化 根据不同的需要将离体培养的细胞分为两类 贴壁依赖型和贴壁非依赖型 或贴壁细胞和悬浮细 胞 1 贴壁细胞 生长时必须要有给以贴附的支持物表面 细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上 生长和繁殖 细胞在表面上生长时有两种形态 成纤维样细胞型和上皮样细胞型 成纤维样细胞型主要来源于中胚层组织细胞心肌细胞 平滑肌细胞成骨细胞等 上皮样细胞型主要来源于 外胚层和内胚层组织细胞 皮肤细胞 肠管上皮细胞 在培养过程中 随着培养条件的变化细胞形态也会 发生改变 2 悬浮细胞 生长不依赖支持物表面 在培养液中悬浮生长 如淋巴细胞等 3 兼性贴壁细胞 根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长 中国地鼠卵巢细胞 第三节 生产用动物细胞的要求和获得 一 要求 最初要求生产用动物细胞必须是原代细胞 以后放宽至二倍体细胞即可 即使是经过多次传代也可用 但 是非二倍体细胞是绝对禁止使用的 因为担心异倍体细胞的核酸会影响到人的正常染色体 有致癌的危险 由于二倍体细胞传代不会超过 50 代 所以使用受到限制 后来发现异倍体也可使用 并未对机体产生影 响 并且可无限使用 对工业生产带来了极大的方便 二 获得 原代细胞 已建立的二倍体细胞系及可无限传代的转化细胞系 1 原代细胞 直接取自动物组织 器官 经过粉碎 消化后获得的细胞悬液 需大量动物 费钱费劳力 2 二倍体细胞 原代细胞经过传代 筛选和克隆 从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株 特点 二倍体 有明显的贴壁和接触抑制特性 有限的增殖能力 无致瘤性 13 3 转化细胞系 通过转化形成 变成了异倍体 有无限增殖能力 转化可自发 在传代过程中自己转变成可无限增殖的细 胞 也可人为转化 采用某些试剂处理 或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系 优点 无限传代 倍增时 间短 对培养条件和生长因子的要求低 适合于大规模工业化生产 三 常用生产用动物细胞的特性 WI 38 人二倍体细胞系 成纤维细胞 能产生胶原 倍增时间为 24 小时 有限寿命 50 代 用于制备疫 苗 MRC 5 人二倍体细胞系 成纤维细胞 有限寿命 42 46 代 用于制备疫苗 CHO K1 从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞 用于构建工程菌 BHK 21 从地鼠幼鼠的肾脏中分离 成纤维样细胞 用于构建工程菌 可生产疫苗 Vero 从非洲绿猴肾中分离 贴壁依赖的成纤维细胞 用于制备疫苗 Namalwa 从淋巴瘤病人分离 生产干扰素 SP2 0 Ag14 从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系融合获得 生产单克隆抗体 四 基因工程细胞的构建和筛选 生产中常采用融合细胞或基因工程构建的工程菌 1 真核细胞基因表达载体的构建 常用病毒或质粒载体 用杆状病毒作载体的优点 该病毒基因是双链的容易进行重组 插入 7 8 千碱基对 不影响正常病毒的形成 可用外源基因更换部分病毒基因 仍具有感染力 有很强的启动子 用光学显微 镜可见 容易挑选阳性克隆 可直接表达外源基因 构建穿梭质粒载体的基本成分 允许载体在细胞内扩增的质粒序列 含有能使基因转录表达调控元件 能 用以筛选出外源基因已整合的选择标记 有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统 2 基因载体的导入和高效表达工程细胞的筛选 融合法 化学法 物理法 病毒法 最常用磷酸钙沉淀和电穿孔法 磷酸钙沉淀法 将溶解的 DNA 加在磷酸氢二钠溶液中 再逐渐加入氯化钙溶液 当磷酸氢二钠和氯化钙形 成磷酸钙沉淀时 DNA 被包裹在当中 形成 DNA 磷酸钙共沉淀 当沉淀物与细胞表面接触时 通过细胞 吞噬作用将 DNA 导入其中 优点是方法简单 可进行共转化 可将不含选择性标记的 DNA 和含选择性标 记的 DNA 放在一起进行形成混合的共沉淀物 一起导入细胞 电穿孔法 借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场 使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔 外源 DNA 即可进入细胞 转化效率较高 但进入的 DNA 拷贝数较低 依靠构建载体内的选择性标记采用相应的筛选系统 HAT GPT G418 MTX 筛选相应的转化细胞 对选 出的细胞要进行克隆和亚克隆使其纯化 五 细胞库的建立 除原代细胞外 其他细胞株 细胞系 包括二倍体 转化细胞 融合细胞和工程细胞都需建立细胞库保存 用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库 原始细胞库和生产用细胞库 原始细胞库应有详细档案 1 该细胞系的历史 来源 动物的年龄和性别 细胞分离的方法和所用的培养材料 2 该细胞的特性 形 态 生长特性 3 对各种有害因子的检查结果 细菌 真菌 支原体和各种病毒 生产用细胞库的细胞来源与原始细胞库 然后经扩增达一定数量后 再分装形成细胞库 第四节 动物细胞的培养条件和培养基 一 动物细胞在体外培养所需条件 1 所有的与细胞接触的设备 器材和溶液都必须保持绝对无菌 避免污染 2 必须有足够的营养保证 绝对不可有有害的物质 避免有害离子 3 保证有食量的氧气供应 4 需随时清除细胞代谢中的有害产物 5 有良好的适于生存的外界环境 渗透压 离子浓度和酸度 6 及时分种 保持合适的细胞密度 14 二 动物培养基的种类和组成 天然 合成和无血清培养基 1 天然培养基 血浆凝块 血清 淋巴液 胚胎浸液 羊水 腹水 2 合成培养基 组成稳定可 大量生产供应 成分为氨基酸 细胞合成蛋白质的原料 维生素