GOLPH3对食管癌细胞系增殖凋亡及放射敏感性影响研究.doc

GOLPH3对食管癌细胞系增殖凋亡及放射敏感性影响研究 ?物理?生物?技术?GOLPH3对食管癌细胞系增殖凋亡及放射敏感性影响研究刘杨蒋月杨原源刘晓徐文才郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院放疗科450008【摘要】目的研究GOLPH3对食管癌细胞系增殖凋亡及放射敏感性的影响。 方法以qRT-PCR和蛋白印迹法分别检测食管癌细胞系和正常食管上皮细胞GOLPH3mRNA和蛋白水平,在OE33细胞中转染GOLPH3siRNA,同时给予照射处理。 MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞克隆实验检测放射敏感性,蛋白印迹法检测活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的Caspase-9(Cleaved Caspase-9)蛋白水平。 结果食管癌细胞中GOLPH3mRNA和蛋白水平明显高于正常食管上皮细胞(P005)。 GOLPH3siRNA可明显下调食管癌OE33细胞中GOLPH3mRNA和蛋白水平。 下调GOLPH3或者照射处理以后的食管癌细胞的增殖活性降低,细胞凋亡率升高,并且细胞中Cleaved Caspase- 3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平也升高(P005)。 下调GOLPH3后的OE33细胞经照射处理以后,细胞增殖活性下降更多,细胞凋亡率和细胞中CleavedCaspase- 3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平升高更多(P005)。 下调GOLPH3后OE33细胞经照射处理后,细胞放射增敏比为1673。 结论GOLPH3在食管癌细胞中高表达,下调其表达可以增加OE33细胞放射敏感性,诱导细胞凋亡并抑制其增殖。 【关键词】食管癌细胞系;凋亡;放射敏感性;GOLPH3基因基金项目:河南省科技厅重点科技攻关项目 (142102310502);河南省卫生厅普通科技攻关项目 (xx03026);河南省卫生厅科技攻关指导性计划 (xx04058)DOI:10.3760/cma.j.issn.1004-4221.2019.08.011Experimental studyof theeffect of GOLPH3on proliferation,apoptosis andradiosensitivity of OE33esophageal cancer cell lineLiuYang,Jiang Yue,Yang Yuanyuan,Liu Xiao,Xu WencaiDepartment of RadiationOncology,Affiliated CancerHospital ofZhengzhou University/Henan CancerHospital,Zhengzhou450008,China【Abstract】Objective Toevaluate theeffect of GOLPH3on the proliferation,apoptosis andradiosensitivityof OE33esophageal cancercell line.Methods Theexpression levels of GOLPH3mRNAand protein in theesophageal cancer cells andnormal esophagealepithelial cells were detected by qRT-PCRand Westernblot,respectively.The OE33esophageal cancercells weretransfected withGOLPH3siRNA andsubjectto irradiationtreatment simultaneously.The cell proliferation was detectedbyMTT assay.The cellapoptosiswasdetectedby flowcytometry.The radiosensitivitywas assessedby cellcloning test.Theexpression levels of cleaved Caspase-3,Bax andcleaved Caspase-9protein levelswere quantitativelymeasuredby Westernblot.Results Theexpression levelsof GOLPH3mRNA andprotein in the esophagealcancercellsweresignificantly higherthan thosein thenormal esophagealepithelial cells(both P005).GOLPH3siRNA couldobviously down-regulate the expression levelsof GOLPH3mRNA andprotein in theOE33esophageal cancercells.The proliferationactivity ofesophageal cancercells wasdecreased,whereasthe apoptosis rate wasincreased andtheexpressionlevelsofcleaved Caspase-3,Bax andcleaved Caspase-9were up-regulated afterdown-regulating theexpression ofGOLPH3or irradiationtreatment(all P005).After down-regulating theexpression ofGOLPH3intheesophageal cancercells treatedwith irradiation,thecell proliferationactivity wasmore significantlydecreased,whereas theapoptosisratewas elevatedand theexpressionlevelsofcleaved Caspase-3,Bax andcleavedCaspase-9were moreevidently up-regulated(all P50个细胞的克隆形成数计算克隆形成率和存活分数。 细胞克隆率=克隆数目/接种细胞数目100%,细胞存活分数=受照射细胞克隆形成率/对照细胞克隆形成率。 根据单击多靶模型参数值计算放射增敏比,增敏比=对照组D0/实验组D0。 8.蛋白印迹法检测Cleaved Caspase- 3、Bax、Cleaved?706?中华放射肿瘤学杂志2019年8月第28卷第8期Chin JRadiat Oncol,August2019,Vol.28,No.8Caspase-9蛋白水平:对照组、照射组、干扰组、干扰+照射组细胞按照上述方法处理以后,继续培养48h。 用蛋白印迹法法测定各组细胞中Cleaved Caspase- 3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平,具体操作同上。 9.统计方法:采用SPSS220软件对多组数据行单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验。 P005为差异有统计学意义。 结果1.GOLPH3在食管癌细胞系中的表达:从表1可以看出OE 33、Eca 109、KYSE450细胞中GOLPH3mRNA和蛋白水平均明显高于正常食管上皮Het-1A细胞(P005),OE33细胞中GOLPH3mRNA和蛋白水平高于Eca 109、KYSE450细胞(P005)。 GOLPH3在食管癌细胞中表达水平升高,并在OE33细胞中表达水平最高,选用该细胞进行后续研究。 表1食管癌细胞OE 33、Eca 109、KYSE450和正常食管上皮细胞Het-1A中GOLPH3mRNA和蛋白水平(MeanSD)细胞系GOLPH3mRNA GOLPH3蛋白Het-1A1.000.180.02Eca1092.320.25a0.350.04a KYSE4502.680.34a0.410.08a OE333.170.36b0.570.04b注:a与Het-1A比P0.05;b与KYSE 450、Eca109比P005),干扰组细胞中GOLPH3mRNA和蛋白水平低于对照组(P0.05;b与对照组比P0.053.GOLPH3下调联合照射抑制食管癌OE33细胞增殖:从表3中可以看出照射组、干扰组、干扰+照射组细胞A值低于对照组(P005),干扰+照射组细胞A值低于照射组、干扰组(P005)。 GOLPH3下调抑制食管癌OE33细胞增殖,并且可以增加照射对食管癌OE33细胞的增殖抑制作用。 表3各组食管癌OE33细胞A值(MeanSD)组别A值组别A值对照组0.470.06干扰组0.390.06a照射组0.350.04a干扰+照射组0.280.02b注:a与对照组比P0.05;b与照射组、干扰组比P0.054.GOLPH3下调联合照射诱导食管癌OE33细胞凋亡:从表4中可以看出照射组、干扰组、干扰+照射组细胞凋亡率高于对照组(P005),干扰+照射组细胞凋亡率高于照射组、干扰组(P005)。 GOLPH3下调诱导食管癌OE33细胞凋亡,并且可以增加照射对食管癌OE33细胞凋亡的诱导作用。 表4各组食管癌OE33细胞凋亡率(MeanSD)组别凋亡率(%)组别凋亡率(%)对照组7.630.56干扰组21.870.19a照射组25.170.25a干扰+照射组37.923.58b注:a与对照组比P0.05;b与照射组、干扰组比P0.055.GOLPH3下调增加食管癌OE33细胞放射敏感性:下调GOLPH3后OE33细胞经照射处理后细胞存活分数降低,表5显示GOLPH3下调增加食管癌OE33细胞放射敏感性。 表5食管癌OE33细胞不同处理后单击多靶模型拟合细胞存活曲线的参数值组别D0(Gy)D q(Gy)SF2增敏比(D0值比)对照组2.2582.3170.7731.673干扰组1.3501.2870.4886.GOLPH3下调增加照射对食管癌OE33细胞中Cleaved Caspaseb- 3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白表达促进作用:从表6中可以看出照射组、干扰组、干扰+照射组细胞中Cleaved Caspase- 3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平高于对照组(P005),干扰+照射组细胞中Cleaved Caspase- 3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平高于照射组、干扰组(P005)。 GOLPH3下调诱导食管癌OE33细胞中Bax表达,促进细胞中Caspase- 3、Caspase-9的活化,并且可以增加照射对食管癌OE33细胞中Cleaved Caspase- 3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白表达促进作用。 表6各组食管癌OE33细胞中Cleaved Caspase- 3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平(MeanSD)组别CleavedCaspase-3BaxCleavedCaspase-9对照组0.260.030.140.020.120.02照射组0.520.06a0.450.06a0.580.05a干扰组0.470.05a0.340.05a0.440.07a干扰+照射组0.850.12b0.890.14b0.870.06b注:a与对照组比P0.05;b与照射组、干扰组比P0.05讨论GOLPH3定位在TGN,主要分布在细胞内的分泌泡以及细胞质膜上,其可以与高尔基体的反面相连,可以快速的从TGN转移到细胞质,是一种新型的癌蛋白,其可以通过增加哺乳动物体内雷帕霉素的靶蛋白活性诱导肿瘤细胞的生长,并且可以通过影响转运蛋白、糖基化等过程发挥癌基因的作用7-9。 在舌癌、乳腺癌等癌症中已经发现GOLPH3的过度表达,并且进一步验证了GOLPH3是一种癌基因10-11。 用免疫组化的方法检测食管癌组织中GOLPH3的表达发现,GOLPH3在食管癌中的阳性率高达773%,远远?806?中华放射肿瘤学杂志2019年8月第28卷第8期Chin JRadiat Oncol,August2019,Vol.28,No.8高于正常的食管组织3333%的阳性率12。 本实验的结果显示,GOLPH3在食管癌OE33细胞中的表达水平高于正常的食管上皮细胞,提示GOLPH3在食管癌中表达升高,与上述研究报道一致。 肿瘤细胞的恶性增殖和凋亡减少是肿瘤难以治疗的重要原因,而这一系列过程需要细胞内多种基因和蛋白的调控。 肿瘤细胞的凋亡水平与肿瘤的类型有关,同一种组织的肿瘤细胞凋亡水平差别也比较大,目前发现的与肿瘤细胞凋亡有关的蛋白有很多,包括Bcl-2家族和Caspase家族,二者是目前公认的与细胞凋亡关系最为密切的蛋白家族13-15。 Bax可以诱导细胞的凋亡,是Bcl-2家族的成员,Caspase家族成员在细胞内以无活性的方式存在,其只有在激活后才可以诱导细胞凋亡的发生,Caspase-9是凋亡的起始因子,而Caspase-3是凋亡的执行因子16-18。 GOLPH3下调可以诱导卵巢癌癌细胞中Caspase-3的活化和Bax的表达,发挥凋亡促进的作用19。 本实验的结果显示,GOLPH3下调可以诱导食管癌细胞中Caspase- 3、Caspase-9的活化,促进Bax的表达,诱导食管癌细胞凋亡,抑制食管癌细胞增殖,并且与照射共同处理以后,细胞凋亡更多,这可能提示,GOLPH3下调通过诱导食管癌细胞凋亡增加食管癌OE33细胞的放射敏感性。 目前尚未发现GOLPH3在肿瘤放射敏感性中的作用,GOLPH3作为一个新发现的癌基因,其作用机制还需要在以后的实验中进行探讨。 本次实验具有一定的局限性,本次实验只是对比了食管癌细胞OE 33、Eca 109、KYSE450和正常食管上皮细胞Het-1A中中GOLPH3mRNA和蛋白水平,筛选了表达水平升高最多的OE33细胞作为研究对象,进行了初步探讨,食管癌细胞系有多株,在以后的实验中会探讨GOLPH3在其他各株食管癌细胞及体内放射敏感性中的作用。 利益冲突刘杨与其他作者宣称没有任何利益冲突,未接受任何不当的职务或财务利益作者贡献声明刘杨负责论文撰写;蒋月、杨原源负责数据分析;刘晓、徐文才负责论文修改参考文献1Steffen A,Schulze MB,Pischon T,et al.Anthropometry andesophageal cancer riskintheEuropean prospectiveinvestigationinto cancerand nutritionJ.Int JCancer,xx,137 (3):646-657.DOI:10.1158/1055-9965.EPI-09-0265.2Zhou Z,Zhen C,Bai W,et al.Salvage radiotherapyin patients withlocal recurrentesophagealcancerafter radicalradiochemotherapyJ.Radiat Oncol,xx,10 (1):1-7.DOI:10.1186/s13014-015-0358-z.3Wang R,Ke ZF,Wang F,et al.GOLPH3Overexpression iscloselycorrelated withpoor prognosis in humannon-small celllung cancerandmediates itsmetastasis throughupregulating MMP-2and MMP-9J.Cell 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