NPY在实验大鼠垂体腺瘤中的表达及意义111

神经肽神经肽 Y Y 及其受体在实验性大鼠垂体腺瘤中的表达及其受体在实验性大鼠垂体腺瘤中的表达 陈来照 马景鑑 摘要摘要 目的目的 研究神经肽 Y 及其受体在实验大鼠垂体腺瘤中的表达 探 索 NPY 在垂体腺瘤形成过程中的作用 方法方法 雌性 Wistar 大鼠 40 只 通过腹 腔注射雌激素的方法建立大鼠垂体腺瘤模型 在此基础上采用放射免疫法测定 大鼠血浆 NPY 的浓度 应用免疫组化 免疫电镜和逆转录聚合酶链反应 RT PCR 的方法分别研究大鼠垂体中 NPY 及其受体的表达 结果结果 1 实验组大 鼠垂体符合垂体腺瘤的诊断标准 2 免疫组化和 RT PCR 研究表明 在实验 组大鼠垂体腺瘤中 NPY 及其 Y1R 和 Y2R 的基因表达水平明显低于对照组垂体 3 免疫电镜显示 NPY 阳性颗粒主要位于腺垂体细胞的内分泌颗粒中 结论结论 通过雌激素诱导 Wistar 大鼠 可以成功建立垂体腺瘤动物模型 实验组大鼠垂 体腺瘤中 NPY 及其受体的表达下调可能与肿瘤的发生有关 关键词关键词 大鼠 垂体腺瘤 神经肽 Y 受体 Expression of neuropeptide Y NPY as well as its receptors in estrogen induced pituitary adenoma in rats CHEN Lai zhao MA Jing jian Department of Neurosurgery First hospital Shan Xi Medical University TanYuan 030001 China Abstract Objective The aim of this study was to explore the expression of neuropeptide Y as well as its receptors in estrogen induced pituitary tumors of Wistar rats to investigate their roles in pituitary tumorigenesis Methods 40 female Wistar rats were divided randomly into experimental and control groups The rats were induced with estradiol benzoate by peritoneal injection in experimental group The expression of NPY as well as its receptors in pituitary glands was also detected by immunohistochemical analysis and semi quantitative reverse transcription polymerase chain reaction RT PCR Some pituitary tissues were also examined using immuno electron microscopy in order to study the distribution of NPY at the subcellar level 基金项目 国家自然科学基金资助项目 30471772 作者单位 030001 太原 山西医科大学第一医院神经外科 陈来照 天津医科大学总医院神经外科 马 景鑑 通讯作者 陈来照 E mail chenlaizhao Results 1 In experimental group significant increases in pituitary weight were noted three months after peritoneal injection of estrogen The serum prolactin concentration also increased sharply 2 The expression level of NPY in pituitary of experimental groups were significantly lower compared to that of control group P 0 001 RT PCR detection also indicated that the gene expression of Y1 and Y2 recepors were decreased in the pituitary tumors P 0 001 3 Immuno electron microscopy examination demonstrated that positive NPY staining with a high density of gold particles located mainly in the secretory granulas Conclusion These data suggest that chronic treatment with estrogen can result in pituitary adenoma in female Wistar rats Eexpression of NPY as well as its receptors Y1R and Y2R was decreased by estrogen in the pituitary glands with possible involvement in estrogen induced pituitary tumorigenesis in rats Key words Rat pituitary adenoma model Neuropeptide Y Receptor 垂体瘤发病机制十分复杂 目前认为垂体瘤发生是多种因素共同参与的病 理过程 NPY是重要的神经内分泌调节因子之一 不仅广泛存在于下丘脑 而 且垂体中也发现有NPY及其受体的表达 NPY对垂体内分泌活动具有重要的调 节作用 但NPY在垂体腺瘤中表达的相关研究十分少见 国内尚未见类似的报 道 本研究采用雌激素诱导法建立大鼠垂体腺瘤动物模型 通过免疫组织化学 免疫电镜以及逆转录聚合酶链反应技术研究垂体腺瘤中NPY及其受体的表达 揭示NPY在大鼠垂体腺瘤形成过程中的作用 材料与方法材料与方法 1 建立动物模型的方法 建立动物模型的方法 4 周龄 Wistar 雌性大鼠 40 只 体重 80 100 g 动物随机分为实验组和对照组 每组 20 只 摘除大鼠的双侧卵巢 2 周后开始 诱导 给药途径为腹腔注射 实验组用苯甲酸雌二醇 对照组用芝麻油 0 5 ml 每次 隔日一次 动物饲养环境室温 22 光照时间 12 小时 日 大鼠可以 随意获取水和食物 诱导时间 12 周 2 动物标本采集 动物标本采集 12 周后经腹腔注射戊巴比妥麻醉 取血 2ml 用于血清 泌乳素 PRL 浓度测定 方法为放射免疫法 取出垂体 称重后等分 一份快速 置入液氮中冷冻 后存于 70 冰箱 用于 NPY 及其受体基因表达的研究 另 一份用 4 多聚甲醛固定 用于组织病理检查 3 垂体组织垂体组织 NPY 免疫组化和免疫电镜 免疫组化和免疫电镜 抗为兔抗鼠 NPY 抗体 抗为 即用型 SABC 试剂盒 SA1022 DAB 显色试剂盒 AR1022 PBS 代替一抗作 阴性对照 具体操作流程按照试剂说明 随机选取实验组垂体腺瘤和对照组垂 体各 2 例进行免疫电镜研究 采用低温包埋技术 抗同免疫组化 抗为胶 体金偶联的羊抗兔 IgG 胶体金直径 10 nm JEM 100CXII 透射电镜观察 4 垂体组织 垂体组织 NPY RT PCR 半定量测定 半定量测定 应用 Primer Express 软件设计 NPY Y1R Y2R 和 actin 特异性引物 所有引物经 Blast Sequence Similarity Search 对比 表明与其它基因无交叉 各引物见表 1 提取组织总 RNA 的 测 定 RNA 质量 分别按照 RT 和 PCR 试剂说明进行 RT 和 PCR 反应 PCR 扩增 产物在 2 琼脂糖凝胶电泳 以 actin 作为对照 对扩增产物进行半定量分析 表 1 PCR 引物序列及扩增片断长度 基因名称引物序列 primer 产物长度 bp GeneBank Number NPY上游 TGGACTGACCCTCGCTCTA 下游 GGGACAGGCAGACTGGTT 348NM012614 Y1R上游 GCTTCTTCTCTGCCCTTCGTG 下游 AGTCTCGTAGTCGTCGTCTCG 546Z11504 Y2R上游 CTTTGAGATTGTAGCCTGTACTGA 下游 GCCAGCTGACTGCAAACACCACTA 254NM023968 actin上游 CCATCATGAAGTGTGACGTTG 下游 ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA 175BC063166 5 统计方法 统计方法 应用 SPSS 11 5 统计软件对实验数据进行分析处理 采用独 立样本 t 检验和 Mann whitney 检验对两组数据进行分析比较 结结 果果 1 大鼠垂体和血清 大鼠垂体和血清 PRL 浓度的改变 浓度的改变 两组大鼠离体垂体标本见图 1 实 验组大鼠垂体体积明显增大 两组垂体重量见表 2 组织切片显示 对照组垂 形态结构正常 见图 2 实验组垂体体积增大 细胞排列紊乱 瘤细胞形态多 样 大小各异 核有异形性 核深染 结构不清 可见红细胞溢出现象 见图 3 两组大鼠血清 PRL 浓度见表 2 实验组大鼠血清 PRL 浓度大约是对照组大 鼠 4 倍 P 0 01 差异有统计学意义 图 1 实验和对照组大鼠离体垂体标本 C 对照组垂体 E 实验组垂体 图 2 对照组垂体前叶 可见排列成团状和条索状的腺细胞以及窦样毛细血管 HE 400 图 3 实验组垂体腺瘤 瘤细胞形态多样 大小不一 细胞核有异型性 可见核仁 HE 400 表 2 两组大鼠垂体重量 血清 PRL 和垂体中 NPY 及其受体基因表达比较 s x 分组 例 数 垂体重量 mg 血清 PRL ng ml NPY mRNAY1R mRNAY2R mRNA 实验组2052 35 4 97198 23 93 070 48 0 200 42 0 210 47 0 12 对照组2012 02 0 7750 12 14 241 10 0 210 58 0 191 28 0 46 t 值29 987 0357 452 677 57 P 值0 0000 0000 0000 0110 000 2 NPY 在大鼠垂体中蛋白水平的表达在大鼠垂体中蛋白水平的表达 在实验组垂体腺瘤和对照组垂体 中 NPY 染色以胞浆着色为主 部分胞核也呈阳性 NPY 免疫组化半定量分析 结果见表 3 统计结果表明 实验组垂体腺瘤中 NPY 表达水平明显低于对照组 腺垂体 差异具有统计学意义 P 0 001 免疫电镜显示 实验组垂体腺瘤细 胞中粗面内质网丰富 且轻度扩张 同时可见密集的内分泌颗粒 电子密度高 而均匀 NPY 标记呈阳性的胶体金颗粒主要位于细胞的内分泌颗粒中 见图 4 对照组垂体前叶细胞内同样可见阳性胶体金颗粒 但密度明显高于实验组垂 体腺瘤 图 4 实验组垂体腺瘤 NPY 免疫电镜显示 胶体金颗粒主要位于肿瘤细胞的分泌颗粒内 免疫电镜 40 000 表 3 实验组和对照组垂体 NPY 免疫组化的半定量分析结果 NPY 表达 分组例数 uP 实验组2011900 对照组2007121 4 320 000 3 NPY 及其受体在实验组垂体腺瘤和对照组垂体基因水平的表达及其受体在实验组垂体腺瘤和对照组垂体基因水平的表达 RT PCR 半定量分析显示 实验组垂体腺瘤中 NPY 及其受体 Y1R 和 Y2R 的基因表 达低于对照组 见图 5 6 和表 2 两者差异有统计学意义 P 0 05 图 5 实验组垂体腺瘤和对照组垂体中 NPY 及其受体基因表达电泳图 M marker Lane 1 对照组 NPY Lane 2 对照组 Y1R Lane 3 对照组 Y2R Lane 4 实验组 NPY Lane 5 实验组 Y1R Lane 6 实验组 Y2R 0 0 5 1 1 5 2 NPYY1RY2R NPY及其受体 基因表达水平 实验组 对照组 图 6 NPY 及其受体在实验组垂体腺瘤和对照组垂体中表达 差异有统计学意义 P 05 讨讨 论论 神经肽由 36 个氨基酸组成 在动物的下丘脑和垂体门脉系统中含量丰富 对神经内分泌活动具有重要的调节作用 有报道认为在腺垂体和垂体腺瘤中也 存在 NPY 表达 1 表明 NPY 不但影响正常垂体的内分泌活动 而且还可能参 与垂体腺瘤的调节 本实验选用 4 周龄 Wister 大鼠 通过腹腔注射苯甲酸雌二 醇建立垂体腺瘤动物模型 无论从垂体重量和血清 PRL 浓度方面 2 还是组织 形态方面 均证实经雌激素诱导可成功获得垂体瘤模型 在此基础上应用免疫 组化 免疫电镜以及 RT PCR 技术 研究 NPY 及其受体在实验性大鼠垂体腺瘤 中表达特点 揭示 NPY 对垂体腺瘤发生和发展的影响 本研究发现 NPY 及其受体 Y1R 和 Y2R 在实验组垂体腺瘤和对照组垂 体中均有表达 但表达水平存在明显差异 NPY 及其受体 Y1R 和 Y2R 在垂 体腺瘤中表达水平明显低于对照组垂体 同时采用免疫组化和免疫电镜技术 从细胞以及亚细胞水平进一步证实在对照组垂体和实验组垂体腺瘤中均存在 NPY 阳性颗粒 NPY 主要位于细胞基质内的分泌颗粒和粗面内质网中 其余细 胞器 细胞基质和细胞核中也有少量表达 且实验组垂体腺瘤细胞中 NPY 颗粒 的密度低于对照组 对照组腺垂体细胞中存在 NPY 表达 表明 NPY 是维持垂 体正常功能不可缺少的调节因子 通过对大鼠腺垂体原代培养细胞的干预研究 发现外源性NPY可以抑制 PRL的分泌 撤除NPY后泌乳素的分泌迅速反弹 该作用与多巴胺的撤退效应 相似 单独使用NPY或与多巴胺联合应用 还可拮抗促甲状腺素释放激素诱导 的垂体PRL分泌 NPY能显著增强多巴胺对PRL分泌的抑制效应 NPY与多巴 胺作用机理相似 通过调节电压依赖性钙通道发挥生物学调节效应 3 表明 NPY对垂体泌乳素细胞具有直接的抑制作用 在本实验中 由于NPY及其受体 在垂体泌乳素细胞中表达下调 使NPY对垂体泌乳素细胞的抑制效应减弱 导 致垂体泌乳素细胞功能亢进 研究表明NPY不仅参与多种生理功能调节 而且 对肿瘤的发生和发展也具有一定的影响 4 垂体功能不仅受下丘脑和外周内分 泌激素的调节 而且垂体自分泌和旁分泌因子也发挥一定的调节作用 5 NPY 可能是垂体的自分泌和旁分泌调节因子之一 对垂体内分泌活动和疾病的发生 发展具有重要影响 研究发现 Y1R mRNA 在大鼠垂体中存在表达 且随着动情周期的变化而波 动 在摘除卵巢后雌激素诱导的早期阶段 雌激素能抑制泌乳素细胞中 Y1R 的 基因表达 通过单位离心沉降法分离垂体泌乳素细胞 发现 NPY 可以直接抑制 泌乳素的分泌 进一步研究显示 Y1R 拮抗剂不能完全抵消 NPY 的作用 6 因 此认为垂体泌乳素细胞中可能存在 NPY 其它受体亚型 本研究证实垂体组织中 同时存在 Y1R 和 Y2R 基因表达 当雌激素诱导发生瘤变时 两者的表达均明 显下调 因此推测两种受体同时介导 NPY 对垂体泌乳素细胞功能的调节 表明 在垂体腺瘤形成过程中 垂体组织中 NPY 及其受体的表达下调可能也与肿瘤的 发生有关 垂体腺瘤形成的基因突变理论认为 体细胞Gs蛋白 链基因发生突变可以 导致垂体肿瘤的发生 当腺苷酸环化酶被持续激活时 使环磷酸腺苷在细胞内 大量聚集 导致垂体细胞异常增殖和分化 7 下丘脑神经肽与腺垂体细胞中相 应的G蛋白藕联受体结合 激活腺甘酸环化酶 影响垂体腺瘤的发生和发展 NPY受体同样也与G蛋白藕联 通过对人前列腺癌细胞株的研究发现 激活 NPY受体可以抑制福斯高林诱导的细胞内cAMP聚集 8 对胶质母细胞瘤细胞株 研究也证实 NPY与肿瘤细胞的Y2R结合能短暂降低细胞内cAMP浓度 9 与 Y1R结合可以加速细胞内的钙流动 降低腺苷酸环化酶的活性 10 因此推测 NPY作为腺垂体细胞的一种自分泌和旁分泌调节因子 与相应的受体结合后可 以抵消下丘脑释放肽对腺垂体细胞的刺激作用 表明NPY对于维持腺垂体细胞 的增殖 分化功能具有重要的调节作用 由于实验组腺垂体细胞中NPY表达下 调 使其丧失NPY的有效调控 导致细胞内cAMP发生病理性聚集 引起细胞 异常增殖和分化 总之 在雌激素诱导的大鼠泌乳素瘤形成过程中 雌激素无疑是肿瘤形成 的主要始动因素 外源性雌激素作用于大鼠的下丘脑和垂体导致肿瘤的发生 实验组垂体腺瘤中NPY及其受体表达下调可能是雌激素引起的继发改变 在肿 瘤形成过程中起协同和促进作用 同时可能与肿瘤内分泌行为有关 参考文献参考文献 1 Grouzmann E Deruaz JP Gomez F et al Immunolocalization of neuropeptide Y in human pituitary tumours Regul Pept 1998 75 76 89 92 2 Magni P Motta M Expression of neuropeptide Y receptors in human prostate cancer cells Ann Oncol 2001 12 S27 9 3 Wang J Ciofi P Crowley WR Neuropeptide Y suppresses prolactin secretion from rat anterior pituitary cells evidence for interactions with dopamine through inhibitory coupling to calcium entry Endocrinology 1996 137 587 594 4 Dumont Y Thakur M Beck sickinger A et al Development and characterization of a highly selective neuropeptide Y Y5 receptor agonist radioligant 125I hPP1 17 Ala31 Aib32 NPY British Joural of pharmacology 2003 139 1360 1368 5 Schwartz J Cherny R Intercellular communication within the ant