细胞培养技术制药

第六章 细胞培养技术制药,动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体胚胎移植核移植,细胞工程常用的技术手段,植物细胞工程,动物细胞工程,植物组织培养植物体细胞杂交,获得细胞,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体,培养结果,或细胞分泌蛋白,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,IN VITRO:（离体的，即在玻璃容器中）用培养细 胞进行的实验IN VIVO:（在体内的）完整机体内进行的实验 生化学家把在活细胞外进行的生化反应叫IN VITRO，在活细胞内发生的生化反应叫IN VIVO,体外细胞培养技术 细胞培养（cell culture）：是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。 优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不受体内环境影响可人为改变条件，进一步观察生理功能的改变。,第一节 哺乳动物细胞培养第二节 植物细胞培养第三节 昆虫细胞培养,1 、动物细胞培养定义,动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。是动物细胞工程的基础。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用。,2、 动物细胞特点,无细胞壁倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成原代细胞培养50代即开始退化,3、 发展历史,1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞,4、 生长特性,贴附生长型 如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞悬浮生长型细胞 如血液白细胞，淋巴组织细胞等,5、 体外培养细胞基本技术,体外培养特点体外培养工具体外培养条件体外细胞生长增殖过程培养方法大规模培养技术,5.1 体外培养特点,营养条件苛刻适应性差, 敏感培养时间长，易污染,Animal cells are more difficult to culture than microorganisms because they require many more nutrients and typically grow only when attached to specially coated surfaces. Despite these difficulties, various types of animal cells, including both undifferentiated and differentiated ones, can be cultured successfully.,Pipets 移液管,单支封装、无菌、一次性 规格 1-100ml 采用不同颜色标示 配合 Pipetboy 使用,5.2 常用培养设备材料,Tubes 锥形离心管和圆底试管,锥形离心管 实验室常用品 用途广泛：样品的离心、收集和存放 圆底试管 用于细胞培养、流式细胞仪等 两种不同的材质：聚丙烯和聚苯乙烯 PP （聚丙烯） 离心速度更高、可耐高温 PS （聚苯乙烯） 价格较低、使用范围广,Cell Cultureware 细胞培养用品,细胞培养板表面处理（组织培养表面）主要规格（6孔、24孔、96孔）低蒸发盖,细胞培养瓶 表面处理（组织培养表面） 瓶盖的设计（酚盖、螺旋塞、透气型） 瓶颈（直颈、斜颈） 生长面积 (12.5 cm2 -300 cm2 ),Cell Cultureware 细胞培养用品,Cell Cultureware 细胞培养用品,滚瓶 （培养面积 850-1450 cm2 ） 细胞培养玻片,Cell Culture Insert,5.3 体外培养条件,温度，37度pH：7.2-7.4气体，氧，二氧化碳，氮气营养条件 需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供,培养条件,无菌、无毒消毒、灭菌抗生素定期更换培养液，清除代谢废物营养合成培养基：糖、氨基酸、生长因子、无机盐、微量元素 （血清、血浆）温度和pH36.50.5，7.2-7.4气体95%空气，5%CO2,.植物组织培养的条件,.概念,Rich Media Are Required for Culture of Animal Cells,Nine amino acids, referred to as the essential amino acids, cannot be synthesized by adult vertebrate animals and thus must be obtained from their diet. Animal cells grown in culture also must be supplied with these nine amino acids, namely, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, and valine. addition, most cultured cells require cysteine, glutamine, and tyrosine. The other essential components of a medium for culturing animal cells are vitamins, which the cells cannot make at all or in adequate amounts; various salts; glucose; and serum, the noncellular part of the blood,Most Cultured Animal Cells Grow Only on Special Solid Surfaces,The extracellular matrices in various animal tissues consist of several common components: fibrous collagen proteins; hyaluronan (or hyaluronic acid), a large mucopolysaccharide; and covalently linked polysaccharides and proteins in the form of proteoglycan (mostly carbohydrate) and glycoproteins (mostly protein).,5.4 体外细胞生长增殖过程,原代培养期传代培养期衰退期,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,10代细胞,传代培养,无限传代,遗传物质未改变,遗传物质改变,接触抑制,.,归纳过程.,动物细胞培养过程,应用,.,.对比,原代培养（primary culture）,用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。,动物细胞原代培养过程图,（1）动物处死：将出生23d乳鼠，用拉颈椎方法处死。背部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球擦拭腰部两侧被毛。（2）取肾及剪肾：在无菌条件下将肾脏取出，置于无菌培养皿中，剪去肾膜和脂肪，用Hanks液洗涤1次；放入另一培养皿中，纵向剪开肾脏，去掉肾盂，将肾剪成1mm3大小的块，再并用Hanks液洗涤23次，直到液体澄清。,方法与步骤,（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌青霉素瓶内，加入56倍量的0.25胰蛋白酶液（pH7.4 7.6），置37水浴中消化20 40min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出青霉素瓶，在超净台中吸去胰蛋白酶液，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。,（4）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30 50万个细胞为宜。（5）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，在培养瓶上做好标记，置于37的CO2培养箱中培养。（6）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。,传代细胞培养（secondary culture）,离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。,（一）贴壁细胞传代培养（1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入23ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。（2）加入2滴管0.25胰蛋白酶消化液，37 消化23min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。（3）用Hanks液洗涤1次，加入12滴管培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。（4）以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 CO2培养箱培养。 （5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。,方法与步骤,（二）悬液细胞的传代培养（1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。（2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1 000 r/min）5min。（3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。（4）以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 CO2培养箱培养。（5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。,细胞系（cell line） 在细胞培养中产生了具有无限增殖能力的变种细胞，这种细胞可被无限的传代。常见的细胞系：NIH3T3细胞系：1963年取自小鼠胚胎细胞建立Hela细胞系：1952年取自人宫颈癌细胞建立,5.5 培养方法,悬滴旋转管灌注小室培养瓶培养板,5.6 大规模培养技术,悬液培养，使用微球载体,6、动物细胞培养技术的应用,生产蛋白质生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。,用于检测有毒物质,获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。,用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据,Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺,DMEM培养基,胎牛血清,其他成分,锥形瓶逐级放大培养,加碱（碳酸氢钠）,加糖（葡萄糖）,灌注培养液,微载体,5L种子罐培养,培养液,50L生物反应器,接种狂犬病毒,出液口,收获病毒,20世纪90年代早期组织工程、细胞治疗和基因治疗的出现为哺乳动物细胞培养技术的延伸与发展提供了一个新的领域。,发展重点已从将细胞作为一个生产生物治疗产品的工厂转变为将细胞本身作为最终的产品，其目标是要治疗一系列疾病。,研究方向包括：干细胞移植、癌症、病毒感染及其他免疫紊乱疾病的治疗、人工器官系统、基因治疗等。,第一节 哺乳动物细胞培养第二节 植物组织细胞培养第三节 昆虫细胞培养,植株培养组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）悬浮细胞器官（胚，花药，子房，根和茎）原生质体（Protoplast）,广义的植物组织细胞培养是指将植物体的细胞、植物原生质体、植物组织及器官甚至幼小植株放在离体的、无菌的人工环境中让其生长发育的方法。主要有：,植物组织细胞培养,愈伤组织培养 Callus culture 器官培养 organ culture 胚培养 embryo culture 悬浮细胞培养 suspension cell culture原生质体培养 protoplast culture 毛状根组织培养 hairy root cultures,植物组织细胞培养方法,植物快繁技术（micropropagation） 把植物器官、组织、细胞或原生质体作为外植体，给予人工培养基和合适的离体培养条件下再生植物的技术，从而达到高速增殖，属离体无性繁殖。 步骤：母株（完整）外植体（母株的一小部分，种子亦可）接种到培养基上长芽（继代增殖）长根（试管外生根亦可）炼苗，驯化完整植株,一、植物组织培养（Plant Tissue Culture） 通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。,植物组织培养技术,植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。(Haberlandt, 1902) 再生: 不同植物种类具有不同再生能力，例如:非洲董叶插， 可于切口处再生新的植株。 增殖：经由细胞分裂，由少变多，由小变大。 器官发生: 再生的途径是经由根或芽等器官之形成。 体胚发生:再生的途径是经由胚之形成。,植物组织培养原理,可培养出与上一代相同特性（具相同优良品质） 的植物。可以大規模地、以小部份组织在试管內倍数不断地培养繁殖。培养液提供养分生長较快。 必須在无菌的环境下操作， 才不會引起细菌、 霉菌感染而失敗。,组织培养的特点,1.选取符合培养目的之培植体2.完全的无菌控制3.良好的人工培养基4.适当的容器5.良好的培养环境,成功的组织培养,1.获得无菌外植体 2.消毒 3.培养基的选择 4.愈伤组织的培养5.试管苗的培养,炼苗，驯化完整植株,植物组织培养步骤,愈伤组织（Callus）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。,茎 頂,茎頂,側芽,茎頂,节间,节位,老叶的成 功率较低,低,高,成功率,有产生愈伤组织与不定芽之傾向,愈伤组织,器官形成,胚形成,菊花叶片培养,二、植物细胞培养 组织培养物分离成单细胞并不断扩增的液体培养技术 过程：将愈伤组织或其它易分散的组织至于液体培养基中，使组织分散成游离的悬浮细胞，进行振荡培养，通过继代培养使细胞增殖，获得大量的细胞群体，生产有用次生代谢产物 采用水平振荡，速率30-150r/min，振幅2-4cm，温度24-30为宜,三、花药培养 花药在烧杯中研碎（有溶剂）过滤浓度梯度离心收集中间层消毒接种培养 花药培养得到的植株染色体数目相当于原植株体细胞染色体数目的一半，又称单倍体植株。,花 器,花药，花粉,花柱,花絲,子房,胚珠,萼片,花蕾內部无菌,愈伤组织,花粉花药培养的意义单倍体细胞中只有一个染色体组，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。品种间杂交育种过程中，通过F1代花药培养得到单倍体后，经染色体加倍立即成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代和常规育种相比，显著缩短了育种年限。,四、原生质体培养 酶解法制备原生质体，在良好的无菌培养基中对原生质体进行培养使原生质体进行生长、分裂，并最终可以长成植株的一种方法。 原生质体培养无机盐的浓度略低,体细胞杂交：将二倍体植物体细胞经离心、振荡等机械方法或采用诱导剂促使不同植物的原生质体进行融合，培养，获得体细胞杂交的植株，由此使自然不杂交的植物获得种间杂交品种。,植物原生质体,原生质体分离与纯化 protoplast isolation,菊花原生质体,五、毛状根培养 发根培养，利用治病农杆菌（包括根癌农杆菌和发根农杆菌）感染植物的外植体使其产生毛状根，并对所产生的毛状根进行无菌培养的技术。形态方面：Ri质粒诱导快速生长的、非定向性、高分支的毛状根的形成代谢方面：Ri质粒转化根能合成与原植物相同或相似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗传稳定性。,毛根状培养,六、胚培养 embryo culture,利用组织和细胞培养技术生产药用成分 植物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢物常存在于细胞内，可以收获细胞进行提取，因所含色素等杂质较少，所以提取过程相对于从原植物中提取要简单一些； 植物培养细胞中有效成分含量高于原植物中的含量； 培养周期短，有利于节约成本大规模生产。,利用组织和细胞培养产生新的化合物 鸡骨常山-利血平 长春花-蛇根碱,利用组织和细胞培养物转化药用成分,植物细胞和组织培养物中含有催化氧化、还原、甲基化、羟基化、异构化、酯化、糖基化、羧基化、去甲基化等多种反应的酶类，可使加入到培养物中的原料转化成有用的化合物。,加入到紫花洋地黄细胞培养中的甲基毛地黄毒素可以被转化成-甲基地高辛。植物细胞和组织培养物的生物转化体系中常含有糖苷化酶，能往一些天然产物上面加上糖基，合成一些苷类物质。可以向药用植物细胞和组织培养物中添加前体，经培养将其转化为目的化合物，以此来增加有效成分的含量。,生产无病原健康植物体及大量繁殖；种源的保存及引种；胚培养及试管受精；花葯培养产生单倍体之育种，愈伤组织及细胞悬浮培养；原生质体培养及遗传工程。药用植物基材生产二级代谢物生产与植物转基因技术结合，大规模生产药用蛋白质,组织培养之应用,植物组织培养之应用,植物组织培养培养商业化应用图,第一节 哺乳动物细胞培养第二节 植物细胞培养第三节 昆虫细胞培养,昆虫细胞培养是从昆虫体内取出细胞, 模拟昆虫体内的生理环境, 在无菌、适温和丰富的营养条件下, 使细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。,它是近年来迅速发展起来的细胞工程中的一个领域， 广泛应用于医学、农业及生物学的各个方面。 目前，其主要应用的两个方面：,利用杆状病毒在昆虫细胞内的感染、复制，以大量生产昆虫病毒作为生物杀虫剂； 大量表达杆状病毒携带的外源基因生产重组蛋白质。,大部分昆虫细胞都利用葡萄糖、果糖或麦芽糖作为主要碳源和能源, 不同种类的昆虫细胞对氨基酸有不同的要求, 至少有14种必需的氨基酸。,一、 昆虫细胞培养基,水解乳蛋白(Lactalbum in Hydrolysate, LH) 和酵母提取物(Yeastolate, YL ) 是昆虫细胞培养基中最常用的添加物, YL 是维生素和嘌呤的主要来源, 而LH 是不定成分氨基酸的主要来源。,天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液； 合成培养基最大的特点是各种成分已知； 无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上, 在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子, 能够保证细胞生长良好无须补加血清的培养基。,1、昆虫细胞培养基的发展,天然培养基、合成培养基和无血清培养基,昆虫细胞培养基的发展主要是合成培养基的发展。 目前已有三种商品化的培养基：Grace 培养基、IPL 41培养基和TC 100培养基。,在经历了天然培养基、合成培养基后， 无血清培养基的研制成为当代细胞培养的重大课题, 虽然血清对细胞的生长很有效， 但是血清的应用还存在缺点： 高质量的动物血清来源有限， 成本高，限制了它的大量使用； 动物血清成分复杂， 各种生物大小分子混合在一起， 有些成分至今尚未搞清楚，对后期培养产物的分离、提纯以及检测会造成一定困难； 血清也是支原体和其它病毒污染的重要来源；每批血清的质量不同, 影响细胞的生长和病毒复制。,2、无血清培养基,到目前为止还没有用血清培养基进行大规模的商业化生产。,数十年来, 大概从三个方面开展了无血清培养的研究工作： 寻找血清代用品； 在培养基中补加必需成分, 如生长因子EGF、FGF 等, 以降低血清用量； 无血清细胞培养用于相关学科研究。,1982年Roder 用蛋黄替代脂类分子成功地培养了几个鳞翅目细胞系； M aiorella等(1989) 以IPL 41为基础通过加入酵母提取物和复杂的脂类代替血清, 成功配制成一个无血清的培养基ISFM