流式最新综述

流式细胞术,曹林,当代生命科学热点,信号传导 研究技术: 二维电泳,流式细胞术,免疫荧光,流式细胞术,流式细胞术是对单细胞定量分析和分选的新技术。激光 光学检测系统 信号 分析。细胞从新生到死亡 从细胞膜到细胞浆和核内物质及染色体，探讨不同物质之间的关系。 细胞中测得多种参数(如DNA、RNA、蛋白质 和细胞体积等)，进行多信息分析。细胞生物学和生物医学研究强而有力的手段。,流式细胞仪称作荧光激活细胞分选器（Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS）,能快速、精确地测量通过检测区液流中的各种粒子。这些粒子可以是细胞、大分子、乳胶滴或其他粒子。,特点,测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理(大小)、化学特性(膜电位,钙流)的多参数测量，并具有明显的统计学意义是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。,广泛应用,基础和临床医学研究，有效研究方法。它在免疫学、肿瘤学、细胞遗传学、病理学、放射生物学等学科中已形成了独立的学科分支。定量分析细胞表面和细胞内抗原，以及对细胞分子水平的核酸含量的测量，这些参数的定量变化已被用于确定正常和异常细胞的分化和生长，预示各种病理状态下细胞的生物行为。,发展史,1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞的计数1934年Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1936年Caspersson等引入显微光度术1940年Coons提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1947年Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器1949年WallaceCoulter提出在悬液中计数粒子的方法的专利1950年Caspersson用显微分光光度计的方法在UV和可见光光谱区检测细胞1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理成功的设计红细胞光学自动数器同年Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置成为流式细胞仪的雏形1954年Beirne和Hutcheon发明光电粒子计数器1959年B型Coulter计数器1965年Kamemtsky等提出两个设想一是用分光光度计定量细胞成分二是结合测量值对细胞分类1967年Kamentsky和Melamed在Moldaven的方法的基础上提出细胞分选的方法1969年VanDillaFulwyler及其同事们在LosAlamosNM(即现在的NationalFlowCytometryResourceLabs)发明第一台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号1975年Kohler和Milstein提出了单克隆抗体技术为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础,工作原理,待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交。该区称为测量区。利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。,细胞仪工作示意图,滤片,流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。,FL-3FL-2FL-1,荧光信号经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上,参数,FSC 物理参数 SSC 物理参数 FL-1 荧光参数FL-2 荧光参数FL-3 荧光参数FL-2A area 荧光参数FL-2W width 荧光参数,FSC,SSC,FSC,SSC,组图,FSC,SSC,FL-1,FL-3,FL-1,FL-1,FL-1,SSC,FL-1,SSC,70.99,25.26,40.75,58.9,60.97,30.66,49.8,47.73,49.60,45.76,75.70,24.06,control,Orid8ug/ml,Orid8ug/ml 12h +trail,Orid4ug/ml 12h+trail,Orid4ug/ml +trail,Orid8ug/ml+trail,荧光补偿,细胞分选,细胞的分选是通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现的。在流动室的喷嘴上装备有一个超声振荡压晶体片，这个振荡装置使自喷嘴射出的液束破碎成千万个小滴，流动的细胞就被分散在这些小水滴中。这时给流束一个电脉冲信号，使小水滴就全部带上电荷。当带有不同电荷的细胞液流经一对带正、负几千伏恒定静电电场的偏转板时，带电的小水滴就根据自身所带的电荷性质产生偏转，落入各自的收集容器中，不带电荷的水滴就进入中间的废液容器中，从而实现了细胞的分选。,A leading supplier for multi-color assays for flow cytometry and reagents for immunological assays,流式细胞术的应用,淋巴细胞亚群分析,膜电位,其它,细胞凋亡,外源性途径:通过细胞外信号激活细胞内的凋亡酶Caspase内源性途径:通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase活化的caspase可以将细胞内重要的蛋白降解,引起细胞凋亡,检测方法,外源性启动信号包括受体的配体,如TNF-Fas Ligand ;跨膜蛋白Granzyme B 颗粒酶B;非蛋白激活物Ca2+ 射线内源性信号反应性氧ROS可以特征性的引起细胞内损伤而诱发发生在线粒体膜上的凋亡典型特征1.线粒体膜电位的丧失2.细胞膜PS磷脂酰丝氨酸的外翻3.细胞核凝固缩和断裂,细胞膜检测方法,PS磷脂酰丝氨酸的外翻Annexin V fl-1细胞膜的完整性 PI & 7-AAD fl-3,细胞膜PS磷脂酰丝氨酸的外翻相关凋亡事件,细胞凋亡早期事件, PS暴露在细胞膜外,Annexin V 分子量35-36KD的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,与PS亲和力高Ka=10-10 ,Annexin V 被标记如FITC,PE.特点快,准确. Annexin V-FITC /PI双染可区分凋亡,坏死和正常细胞.凋亡细胞膜完整,坏死细胞膜破碎. PI可嵌人DNA的红色发光物质,不能通过完整的细胞膜,但是可以进入坏死细胞,Time Course of TRAIL Induce Jurkat Cell Apoptosis,Dose Course of TRAIL Induce Jurkat Cell Apoptosis,细胞核相关凋亡检测,凋亡峰(DNA小片段峰)的检测DNA Ladder PI, 7-AAD TUNEL法,细胞周期,DNA含量,0,200,400,600,800,1000,PI 荧光强度(DNA含量),DNA含量分析(PI法),2N,4N,Counts,G0/G1,G2/M,S,DNA断裂,TUNEL 法,DNA断裂在凋亡初期形成200-250kp或30-35kb的大片段晚期进一步在核小体间断裂,形成180-200bp的DNA断裂碎片TUNEL(TdT mediated Dutp Nick End labeling) : 不依赖模板的方式在双链或单链DNA的离3-OH末端将dUTP逐个加上 底物可以是 dUTP或BrDU(无或有荧光标记) 显示凋亡时DNA断裂的程度,直方图,Caspase相关检测,Caspase 抑制性底物如DEVD,VDVAD,IEHD,LEHD,VAD上标记FITC绿色或sulfo-rhodamine红色成为FITC-多肽-FMK或sulfo-rhodamine-多肽-FMK,标记物细胞膜通透性很好且无毒,在细胞凋亡中可与活化的Caspase不可逆的结合,反映活化的Caspase的量,线粒体相关检测,JC-1该染料很容易进入正常细胞的线粒体中并以多聚体的形式存在,发出红色荧光,凋亡细胞中线粒体膜电位崩溃,此染料无法聚集在线粒体中,只能以单体的形式存在细胞质中,发出绿色荧光,红绿荧光可以区分出正常和凋亡细胞FL-1通道检测 峰图细胞色素C释放来检测ADP/ATP比列 增殖细胞ATP水平高,凋亡细胞ADP水平提高,ATP水平下降,坏死细胞更显著 luciferin+ATP+O2 Oxyluciferin+AMP+P+light谷胱甘肽 细胞凋亡早期GSH水平下降 GSH用来清除ROSNO检测 凋亡细胞中NO合成的速度远高于正常细胞,Luciferase,Mg2+,细胞增殖,CFSE一种荧光染料,能跟细胞骨架蛋白结合.细胞先用过量的CFSE染色,使骨架蛋白结合染料,洗去未结合的染料,再把细胞进行培养.细胞分裂一代,染料平均分配到子细胞中去,荧光减少一半,表面抗原的检测,基于抗体的检测 将细胞表面特异的抗原的抗