章 微生物鉴定岗位

项目十一 微生物鉴定岗位,知识目标,1.掌握微生物新陈代谢的类型和特点。2.掌握微生物合成代谢产物的种类、医学意义，以及分解代谢常见的类型。3.掌握常用的微生物生化试验的原理、方法、结果判断及用途。4.熟知微生物检测中常用的快速鉴定试剂盒。,技能目标,1.学会微生物生化试验的接种方法。2.学会正确观察微生物生化试验的结果。3.复习微生物常用的接种方法。,岗位描述,该岗位的任务是利用不同微生物对外界物质不同的代谢作用和所产生代谢产物的不同，进行微生物的鉴定和分型，提供疾病的辅助诊断、疗效评估、预后判断及药品、食品、化妆品菌检判断所需的重要生物学参数。该岗位的从业人员除了要有微生物培养、接种技术外，还必须具备一定的微生物生物化学知识，能根据一定的生化反应现象进行结果判断。,任务一 认识微生物的新陈代谢,概念: 微生物在其生理活动过程中，一方面不断从外界环境吸收营养物质，经过一系列复杂的生化反应过程，转化为细胞生理活动过程中有用的物质；另一方面又不断向外界排泄出废物，以维持细胞的正常生长和繁殖，这就是微生物的新陈代谢。 物质代谢（分解代谢、合成代谢） 能量代谢（产能代谢、耗能代谢）,一、微生物新陈代谢的特点,分解代谢（异化作用）：复杂有机物 简单化合物释放能量合成代谢（同化作用）：简单化合物 复杂有机物消耗能量,一、微生物新陈代谢的特点,摄取的营养物质,细胞组成物质,自身细胞内复杂的细胞物质及环境中大分子营养物质,初级代谢：合成细胞生长、繁殖必需的物质， 如：氨基酸、蛋白质、核酸、维生素次级代谢：合成细胞生长、繁殖无显著作用的物 质 如：抗生素、色素等,一、微生物新陈代谢的特点,细菌产生的酶 部位分：胞内酶 胞外酶（与细菌毒力有关）生成条件分：固有酶（与遗传有关） 诱导酶特点：温和性、高效性、专一性,一、微生物新陈代谢的特点,一、微生物新陈代谢的特点,微生物新陈代谢有三个突出的特点： 新陈代谢十分活跃； 新陈代谢类型多样化； 新陈代谢途径灵活,二、微生物的新陈代谢产物,微生物新陈代谢产物主要有：,1.热原质2.侵袭性酶及毒素3.色素4.抗生素5.细菌素6.维生素,注入人体或动物体内可引起发热反应。耐高温特性，不被121高压灭菌所破坏，可用吸附法、蒸馏法、滤过法、热破坏法（250干热45min）、强酸强碱处理法去除。,某些微生物在代谢过程中产生的微量就能选择性的抑制或杀灭其它微生物或肿瘤细胞的物质,某些细菌菌株产生的,仅能对一些与其产生菌密切相关的细菌有作用的一类具有抗菌作用的蛋白质或蛋白质与脂多糖的复合物。,透明质酸酶（利于扩散）,链激酶（利于扩散）,链道酶（利于扩散）,血浆凝固酶（抗吞噬）,二、微生物分解代谢的类型,微生物的分解代谢主要是对糖、蛋白质和脂肪的代谢过程：,1.糖类的分解2.蛋白质的分解3.脂肪的分解,任务二 认识生化检测原理、用途及方法,一、原理及用途,由于各种不同种类的微生物具有各自独特的酶系统，因而新城代谢过程中对底物的分解能力不同，其代谢产物也必定有所差异。用一些生物化学反应测定这些具有不同特性的分解或合成代谢产物，可作为区别和鉴定微生物种类的重要依据之一。这就是微生物的生物化学鉴定试验。现已有数百种独立的生化测试可供选用，每一种测试都可检测某种特定的酶或生理活性是否存在。只要将这些生理生化测试中的某几项联合使用就可以描述出某种特定细菌的特征。,生化检验的目的：,通过生化反应现象的不同，区别和鉴定微生物种类。,二、常用的生化反应试验,微生物的分解代谢主要是对糖、蛋白质和脂肪的代谢过程：,1.糖类发酵试验2.甲基红试验3.VP试验4.枸橼酸盐利用试验5. 吲哚试验6. 硫化氢试验,1.糖类发酵试验,微生物利用单糖、双糖、多糖、醇类、有机酸等各种碳源的能力不同，发酵状况可通过倒置试管中收集的气泡看出。,二、常用的生化反应试验,（一）、糖发酵试验,葡萄糖,大肠杆菌,伤寒杆菌,产酸、产气,产酸、不产气,乳糖,大肠杆菌,伤寒杆菌,产酸、产气,不分解,区别大肠与伤寒杆菌,检测pH,通过在倒置试管中收集的气泡看出,空白对照伤寒杆菌大肠杆菌,糖发酵试验,气泡,变黄色,二、常用的生化反应试验,色氨酸,产气杆菌,吲哚,不产生吲哚,大肠杆菌,二甲基氨基苯甲醛,红色,阳性,阴性,（二）吲哚试验（I） ：,二甲基氨基苯甲醛,无色,试验原理：,常可用于大肠埃希菌与产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等肠杆菌科的鉴别。,吲哚试验,阳性,阴性,大肠杆菌：+产气杆菌：-,葡萄糖,产气杆菌,小分子酸,乙酰甲基甲醇,大肠杆菌,甲基红,红色,阳性,阴性,（三）甲基红试验（ M ）：,甲基红,橙色,试验原理：,二、常用的生化反应试验,常用于肠杆菌科内某些属种的鉴别,甲基红试验,阳性,阴性,大肠杆菌：+产气杆菌：-,葡萄糖,产气杆菌,小分子酸,乙酰甲基甲醇,大肠杆菌,精氨酸,无色,阳性,阴性,（四）乙酰甲基甲醇试验（ V ）：,红色,pH7,精氨酸,pH7,试验原理：,二、常用的生化反应试验,本试验常与甲基红试验一起使用，一般情况下，VP试验为阳性的细菌，甲基红试验常为阴性，反之亦然。,V-P试验,阴性,阳性,大肠杆菌：-产气杆菌：+,枸橼酸钠,产气杆菌,不生长培养基呈中性,生长使培养基pH7,大肠杆菌,不变色,阳性,阴性,（五）枸橼酸盐利用试验（ C ）：,蓝色,溴麝香草酚蓝,溴麝香草酚蓝,试验原理：,在以枸橼酸钠为惟一碳源的培养基上接种,二、常用的生化反应试验,可用此试验作细菌种属间鉴定，,枸橼酸利用试验,大肠杆菌：-产气杆菌：+,阳性,阴性,二、常用的生化反应试验,IMVC试验,符号表示：,I：代表吲哚试验M：代表甲基红试验V：代表乙酰甲基甲醇试验C：代表枸橼酸盐利用试验,IMVC试验,试验用途：,常用于大肠杆菌和产气杆菌的鉴别。,二、常用的生化反应试验,IMVC试验,大肠杆菌与产气杆菌鉴别结果：,二、常用的生化反应试验,（六）、硫化氢试验,试验用途：,常用来鉴别肠道杆菌的种类：如:沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌 属、爱德华菌属为阳性 大肠杆菌、产气杆菌为阴性,二、常用的生化反应试验,试验原理：,培养基中的含硫氨酸,沙门菌属,H2S,醋酸铅硫酸亚铁,黑色,阳性,大肠杆菌产气杆菌,不产生H2S,阴性, 所属类型：氨基酸和蛋白质试验,（六）、硫化氢试验,二、常用的生化反应试验,硫化氢试验,乙型副伤寒杆菌：+大肠杆菌：-,阳性,阴性,三、微生物快速检测技术,微生物快速检测法是近年来不断取得进展的一种新型的检测方法，常见的有：,1.快速测试片法2.选择、鉴定用培养基法3.生物化学技术4.微生物快速鉴定和自动化分析系统,（一）快速测试片法,是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定受检样品中微生物的方法。快速检测纸片产品，可以检测乳酸杆菌、沙门菌、葡萄球菌等。 快速检测法与传统检测方法之间的相关性非常好，如用大肠菌群快速检测纸片的特异性和敏感性与发酵法符合率均较高。有些快速检测法中还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果。,（二）选择、鉴定用培养基法,在培养基中加入特异性的生化反应底物、抗体、荧光反应底物、酶反应底物等，可使目标培养物的选择、分离、鉴定一次性完成。 如生物一梅里埃公司的BP+RPF(兔血浆+纤维蛋白原)培养基，可在24h内鉴定金黄色葡萄球菌。Merk公司的培养基上，大肠杆菌可为墨绿色至紫色菌落，沙门菌为淡绿色至蓝绿色菌落。柠檬酸杆菌和克雷伯杆菌为橙红色至红色菌落，其他肠道菌为无色菌落。,（三）生物化学技术,1.PCR技术 PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。优点：灵敏度高，节约了大量时间缺点：增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性2.基因探针技术 利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补的原理，采用特异性基因片段制备基因探针来识别细菌。优点：减少了基因片段长度多态性所需要分析的条带数缺点：不能鉴定目标菌以外的其他菌,（四）微生物快速鉴定和自动化分析系统,1.微量多项试验鉴定系统 也称为数码分类鉴定法和简易诊检技术，基本原理是通过数学的编码技术，将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立对应的数据库或编成检索本。其计算步骤分为出现频率的计算、对照检索本数据谱得出结果、结果解释三个部分。,（四）微生物快速鉴定和自动化分析系统,2.自动化的微生物鉴定系统（1）半自动化细菌鉴定,1. BBLCrystal半自动细菌鉴定系统2. AutoScan-4半自动细菌鉴定系统3. VITEK-ATB半自动细菌鉴定系统4. AutoReader半自动细菌鉴定系统,（四）微生物快速鉴定和自动化分析系统,2.自动化的微生物鉴定系统（2）全自动化微生物鉴定,1. VITEKAMS系统2. MicroScan系统3. PHOENIXTM系统4. Biolog系统,（四）微生物快速鉴定和自动化分析系统,3.使用自动化鉴定系统的注意的问题,1.自动化鉴定系统自身数据库资料有待完善2.用户应及时更新鉴定系统数据库3.将自动化鉴定仪的结果和细菌的其他生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，尽量避免错误的鉴定。,【知识检测】1.对鉴别细菌有意义的细菌代谢产物是 A.维生素 B.色素 C.侵袭性酶 D.抗生素 E.毒素 2.内毒素的毒性部位在A.特异性多糖 B.脂多糖 C.核心多糖 D.类脂 E.脂蛋白3.关于外毒素的叙述不正确的是A.主要化学成分是蛋白质 B.可以经甲醛脱去毒性变成类毒素 C.所引起的毒性反应基本相似 D.化学性质不稳定性 E.大多数由革兰阳性菌产生和分泌,4.下列不属于细菌生化反应试验的是A.吲哚试验 B.半固体试验 C.硫化氢试验 D.甲基红试验 E.糖发酵试验5. VP试验属于是A.糖代谢试验 B.氨基酸代谢试验 C.蛋白质代谢试验 D.碳源利用试验 E.酶试验,【技能训练】,任务情景,某牛奶加工厂接到订单，需要生产一批酸奶。（点评：根据微生物发酵技术利用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的发酵作用生产酸奶。）,实训二十 纸片法快速检测 食品中大肠菌群,任务描述,一、目的1.熟悉3M大肠菌群快速检验测试片的使用规程。2.学会纸片法检测受检食品中大肠菌群。3.能够对检测结果作出准确的判断。,任务描述,二、原理 3M大肠菌群测试片含有改良的VRB培养基，冷水可溶性凝胶和四唑嗡指示剂，可增强菌落计数效果，表面覆盖的薄膜可留住发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。大肠菌群为革兰阴性杆菌，发酵乳糖产酸产气，大肠菌群菌落在大肠菌群测试片上生长产酸，pH指示剂使培养基颜色变深，在红色菌落周围有气泡者，为大肠菌群。,任务描述,三、准备1.器材及试剂3M大肠菌群速检验测试片试剂盒无菌稀释液灭菌吸管培养箱均质器待检食物。,任务描述,四、操作步骤1.取样 2.稀释 3.调整pH 4.揭膜 5.加样 6.压板 7.培养 8.显色 9.结果 10.