广大-土壤中分离芽胞杆菌---副本.doc

综合性实验方案土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定 一、摘要 本实验通过从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存，试验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定，根据伯杰氏细菌手册鉴定其中的种属。 实验中通过80水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌；再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过分区划线对初筛选菌株进一步分离纯化；然后再用选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉酶，以及产芽孢的杆菌，最后通过对产淀粉酶芽孢杆菌做相关的生理生化实验，将筛选出来的菌株进行鉴别，鉴别到了地衣芽孢杆菌和环状芽孢杆菌。 关键词：芽孢杆菌 淀粉酶 酶活测定二、实验目的要求1、 了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用的方法和技术；2、 掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；3、 掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法；4、 培养学生自行设计实验方案流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力；5、 对所学习过的微生物实验方法井陉综合技能训练；6、 从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各种淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况；三、实验原理 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由有一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单的菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 芽孢杆菌是土壤细菌中最具活力的部分之一，也是土壤细菌的主要种群之一。 芽孢杆菌属实一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。多数为腐生菌，主要分布于土壤、动植物体表及水体中。由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体，因此，在工、农业生产商有较高的应用价值。4、 实验材料与方法1、 实验材料1.1土样的采集选取广大理南前面、广大生化楼前小河附近两处的土壤，五点法采集，边长15cm。铲去表层土，去10cm深土壤，每一个土样约200g左右（每个点40g)。将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型，4冰箱中保存备用。分别记做A土样、B土样。1.2培养基淀粉筛选培养基淀粉20 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂10 g，自来水1000 ml，pH自然。斜面种子培养基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂1015 g，自来水1000 ml，pH 7.27.4。蛋白胨液体培养基（做吲哚实验用）蛋白胨10 g，NaCl 5g，自来水1000 ml，pH 7.27.4，121灭菌20 min。葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验用）蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5g，自来水1000 ml，pH 7.27.4，121灭菌20 min。糖发酵培养基（做糖酵解试验用：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇）蛋白胨2 g，NaCl 5g，K2HPO4 0.2g，1%溴麝香草酚蓝水溶液3ml，待试糖10g（一般糖或醇按1%量加入，而乳糖，半乳糖按1.5%的量加入），自来水1000 ml，pH 7.27.4，121灭菌20 min。络氨酸平板（做络氨酸水解试验用）A：L络氨酸0.5g，悬浮于10ml蒸馏水中，110，20min灭菌；B：称取3.3g营养琼脂，蒸馏水100ml，121，20min灭菌；然后将A液倒入融化至温热的100ml无菌的营养琼脂中，混合，即成络氨酸水解平板。络素平板（做络素水解试验用）A：取5g脱脂奶粉加入50ml蒸馏水中，110，15min灭菌B：另称1.5g琼脂溶于50ml蒸馏水中，121，20min灭菌。待冷至4550时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥；硝酸盐培养基硝酸钾0.2g、蛋白5g、蒸馏水1000mL、pH7.4、硝酸盐还原试剂甲液：将对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L，乙酸溶液100mL中。乙液：将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。制法（溶解，校正pH，分装试管，每管约5mL，121高压灭菌15min。）西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（做柠檬酸盐利用试验用）柠檬酸钠2g，NaCl 5g ,MgSO4.H2O 0.2g，K2HpO4.3H2O 1g，（NH4)2HPO4 1g，1%溴麝香草酚蓝水溶液10ml，琼脂15-20g，自来水1000ml，pH7.0，121灭菌20 min。淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂1520g，蒸馏水1000 ml，pH 7.27.4。(2%、5%、7%、10%）高盐培养基（做耐盐试验用）牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl（2g，5g，7g，10g），琼脂1015 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.27.4。明胶培养基（做明胶液化实验用）牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，明胶12g，蒸馏水1000 ml，pH7.0半固体培养基（做运动性试验用）琼脂含量0.5%，其他组分比例按牛肉膏蛋白胨培养基配制。pH5.7肉汤蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH5.70.001%溶菌酶试验蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH7.2-7.4卵黄试验组分一：33g营养琼脂，1%葡萄糖，蒸馏水1000ml组分二：5ml无菌生理盐水，5ml卵黄（移液枪无菌注射器吸取），混匀向50保温的组分一中加入组分二5ml，混匀，倒平板，4，过夜备用1.3试剂耐盐性试验：NaCL粉末糖酵解试验：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇。革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇，0.5%沙黄染色液；芽孢染色：5%孔雀绿染色液，0.5%石碳酸复红。单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红。VP试验（MR试验）40%NaoH溶液，a-萘酚吲哚试验：乙醚、吲哚试剂碘原液：碘11g，碘化钾22g，加水定容至500ml硝酸盐试验：甲液（对氨基苯硫酸0.8g+5mol/L醋酸100ml; 乙液（a-萘胺0.5g + 5mol/醋酸100ml）;酪素水解：脱脂奶粉（牛奶）；酪氨酸水解：L酪氨酸 溶菌酶抗性实验：溶菌酶卵黄反应：新鲜鸡蛋硝酸盐试验：硝酸盐明胶液化试验：明胶柠檬酸盐利用试验：西蒙斯氏柠檬酸盐淀粉酶活力测定：1% 3,5-二硝基水杨酸试剂1.3.2 仪器； 无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载玻片，吸水纸，涂布器，显微镜，移液管，移液枪等。恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，恒温水浴箱，磁力搅拌器等。 2、试验方法 2.1 土壤样品悬液制备 2.1.1 土壤悬液制备各称取22.2g 土壤样品于装有200ml 无菌水的400ml 锥形瓶中，加入玻璃珠与土壤悬液一起振荡，制成土壤悬液。置于100沸水10 min,以杀死非芽孢杆菌。静置5min.2.1.2 土壤悬液稀释吸取上清液1 ml 加到含有9 ml 无菌水的试管中，配成102 g/ml 的土壤悬液，并进一步稀释至103 g/ml、104 g/ml , 共三个浓度梯度。2.2 分离纯化2.2.1 芽孢杆菌属的纯培养涂布分离：分别吸取不同稀释度的土壤悬液0.1-1 ml 于牛肉膏蛋白胨平板上，用无菌玻璃涂棒涂布均匀。每个稀释度2 个重复，37倒置培养24h。划线接种：每个土样挑5个形态特征不同的单菌落。（一个平板一个细菌，并且分好区），挑取一个菌株，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约60角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次平行划线部分作第三次平行线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置37倒置培养12h，再继续分区划线2-3次，以获取较纯的菌种。（判断纯不纯的方法是：通过革兰氏染色观察，方法在下面；还要通过芽孢染色确定纯菌种为芽孢杆菌，两个试验都通过后，在进行菌种的保存，方法在下面）2.2.2经单染色镜检直至得到纯菌种挑取上述划线所培养的部分菌种出来进行革兰氏染色镜检，若发现视野内出现形态、大小、颜色一致且为杆状的菌体，则将其对应的菌种划线接种到新的营养琼脂平板上，标记，37倒置培养24h，否则继续进行划线分离，培养后再经革兰氏染色镜检直至得到纯种杆菌。染色步骤涂片、干燥、固定；染色：在涂有菌种的载玻片上滴加草酸铵结晶紫或石碳酸复红盖住有菌的部分，染色，1-2min，倾去染液，用水冲洗直至无染色液为止。镜检：用油镜观察；单菌落：菌落的形状、颜色、质地、透明度一致、菌体形态为直杆状，长度均一、宽度一致，并能产生芽孢时，确认为芽孢杆菌属的纯培养物。2.2.3芽孢染色分离芽孢杆菌（24h菌种）挑取已纯化的菌种，进行芽孢染色，确定菌株为芽孢杆菌，确定后。将纯化得到的单菌落分为两部分，其中一部分接种到培养基内，用以保存菌种，另一部分用来做其他试验。染色步骤涂布、干燥及固定；初染：于涂片上加入2-3滴5%孔雀绿水溶液，加热，用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，边加热边滴加染色液，自载玻片上出现蒸汽时，开始计时，约4min；脱色：倾去染液，待玻片冷却后，水洗至孔雀绿不再褪色为止；复染：滴加沙黄染色液，染2-3min，水洗；镜检：用油镜观察染色结果。芽孢呈绿色，菌体呈红色。2.2.4 产淀粉霉菌株的筛选淀粉水解实验挑取颜色、质地不同的单菌落，划线接种于可溶性淀粉培养基中，每种菌株做2个平板，将接种完成得平板置于37恒温箱中倒置培养24h。取一个平板，马上加碘液，立即观察记录是否有透明圈出现。将有透明圈的菌株做好标记。2.2.5斜面保存菌种取各种无菌斜面试管数支，将有透明圈的菌株（用平行的培养基里面的菌种）接种到斜面，贴上标签，其距试管口2-3cm处。每种要菌接3管，加塞、包扎好到37倒置培养24h。2.3 初步鉴定2.3.1 形态学鉴定 将所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态、高度、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味等。然后进行一系列的镜检革兰氏染色、芽孢染色（具体步骤同上）观察是否符合芽孢杆菌的指标。2.3.2生理生化鉴定（所有生化试验之前都要活化菌种：从冰箱中取出菌体，重新接种到斜面上，培养12-20h，使之达到对数期）革兰氏染色步骤涂布：从各纯培养的平板中挑取菌种于载玻片上，滴加无菌生理盐水；干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥；固定：涂面朝上，通过微火2-3次。初染：在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染色1min，倾去染液，用水冲洗至无染色液颜色为止；媒染：滴加石碳酸复红，染1-2min，水洗；脱色：滴加95%乙醇，将玻片摇晃几下倾去乙醇，重复2-3次，立即水洗；复染：滴加石碳酸复红，染2-3min，水洗；镜检：用油镜观察染色结果温度对微生物生长的影响：将牛肉膏蛋白胨培养基融化倒平板（培养基厚度为15-20cm）,使用牛肉膏蛋白胨培养基，将菌株十字接种到平板，分别在5C、15C、25C、30C、35C、40C、45C、50C、55C、60C、65C条件下培养24h，观察细菌是否生长。糖类发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）-直接观察记录取斜面培养菌种接种于37C温箱中培养24h；观察培养基是否变色，杜氏小管是否有气泡，以证实菌株是否产酸产气。VP试验取葡萄糖蛋白胨培养基，接种37C培养两天；取出以上试管，每个管分别加入40%NaoH溶液10-20滴（5-10d 40%KOH)，并加入等量5%萘酚，震荡试管，以使空气中的氧融入，置于37C恒温箱中保温15-30min后，若培养液呈现红色，记为阳性（+）反应，若不呈现红色则记为阴性（-）。MR试验取葡萄糖蛋白胨培养基，接种37C培养两天；取出以上试管，每管分别加入甲基红2滴（向另一半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入甲基红2d)，震荡，若培养液呈红色，记为阳性（+）反应，若不呈红色，记为阴性（-）。吲哚试验取蛋白胨水培养基，接种，37C培养两天；取出试管，在培养基中加入乙醚1-2ml，经充分震荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液上面，此时沿管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，为吲哚试验阳性（+），否则为阴性（-）。柠檬酸盐利用试验取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜面的试管，分别将少量菌苔接种于各支相应的管中，然后置于37C恒温箱中培养24h。观察结果，若培养基变蓝色，则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长，即为阳性（+），若培养基无变色，则为阴性（-）。耐盐性试验将分离获得的细菌分别接种在NaCl浓度为2%，5%，7%，10%，的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于37C下培养，观察生长情况，并做记录。硝酸盐还原试验被检菌接种于硝酸盐培养基中，置于35C中培养1-4天，将甲、乙液等量混合后（约0.1ml）加入培养基内，立即观察结果，若出现红色为阳性。明胶液化试验穿刺接种，深度至明胶层2/3处，于37C恒温箱培养24h；取出后静置于冰箱中，待其凝固后，再观察其是否被细菌液化，如果被液化，则为阳性，能产生蛋白酶。运动性试验使用半固体营养琼脂试管，将接种针从直立柱培养基中央自上而下直刺到离管底1-1.5cm处，沿原穿刺线拔出接种针。置于37C温箱中培养24h；观察是否产生树根状生长，若有，则菌株有鞭毛，