报告基因检测系统

第六章 报告基因检测系统 公司现已发展的有三种报告基因检测系统 NF Kb p53 NFAT 根据待检基因对其 作用的原理 及在药物 抗体等作用下 产生的不同效果 这三种报告基因系统又 具体可以分为 NF kB 刺激系统和 NF kB 抑制系统 p53 刺激系统和 p53 抑制系 统 NFAT 刺激系统和 NFAT 抑制系统 1 NF kB 报告基因检测系统 NF kB 刺激系统 NF kB 抑制系统 1 1 细胞培养 1 细胞株及材料 细胞株 293 T 细胞 培养基 DMEM 10 FBS GBICO DMEM 无血清 培养器皿 T75 75cm2 培养瓶 以下相同 24 孔细胞培养板 2 细胞培养及铺板 a 传代 用 DMEM 10 FBS 培养基接种 293T 至 75 cm2 培养瓶 细胞长满后铺板 并传代 注 一般一瓶细胞总数可以达到 3 107 个 可以按 1 8 分瓶 b 铺板 细胞消化 将培养好的 293 T 细胞 倾去培养基 加入 1 2ml1 胰酶轻轻摇晃以 覆盖整瓶细胞 37 培养箱放置 2 3min 观察细胞从瓶壁上脱落下来 也可以用 手拍击瓶壁 显微镜下观测到细胞成单个 或是只有 2 3 个细胞聚团 即可以加 入含有血清的 DMEM 10 FBS 10ml 左右 终止胰酶的消化作用 随后从中取少量 细胞计数 细胞计数 如果细胞密度较大 可按一定倍数稀释后计数 细胞密度的计算按照公 式 细胞密度 单位 个 ml 4 个大方格的细胞总数 4 104 稀释倍数 铺板 24 孔板按照每孔 1 0105 NF kB 刺激系统 或 0 8105 NF kB 抑制系统 接种体积为 500L 来铺板 细胞加入后将 24 孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动 勿转动 使细胞 能够均匀分布 放置细胞培养箱生长 1 2 转染 1 试剂及材料 转染试剂 Lipofectamin 2000 质粒 a 对照质粒 pEF BOS TRAF6 NF kB 刺激系统 Dominant negative TRAF6 NF kB 抑制系统 b NF kB luc report plasmid c 目的基因质粒 构建在 pEF FN 载体上 2 转染 铺板后 24 小时转染 每个样品须作 3 个重复孔 目的是为消除实验误差 并且在 24 孔板上相应位置做好标记 在 A B 两个 eppendorf 管中分别加入 A 0 1g NFkB luc reporter gene 0 4g interest gene serum free DMEM 至 终体积 50l 孔 B 1 5L lipofectamine 2000 48 5L serum free DMEM 体积为 50l 孔 室温放 置 5min A B 二者混合 室温放置 20 30min 后将混合液缓慢而均匀的加到 24 孔板细胞液 中 每孔为 100L 轻轻摇晃 使 DNA 分布均匀 培养 24hr NF kB 刺激系统 negative cotrol pEF BOS positive control TRAF6 NF kB 抑制系统 negative cotrol pEF BOS positive control Dominant negative TRAF6 TRAF6 DN 进一步具体转染方法可以参照 Lipofectamin2000 的说明书 1 3 细胞收获及处理 刺激因子 TNF 肿瘤坏死因子 母液浓度 2g Ml 使用浓度 20ng ml Buffer 5 PBL 裂解液 Tricine pH7 8 40 mM NaCL 50 mM EDTA 2 mM MaSO4 1 mM DTT 5 mM Triton X 100 1 1 NF kB 刺激系统 转染后 24 小时先通过荧光显微镜观察 GFP 表达的强弱以判断转染效率 处理细 胞 2 NF kB 抑制系统 转染后 24 小时先通过荧光显微镜观察 GFP 表达的强弱以判断转染效率 加药刺激 TNF 用 DMEM 培养基稀释后 200l 孔换液 加药刺激 12 16 小时后收细胞 3 细胞处理 吸干培养液 24 孔板中每孔加入 1 PBL buffer 在摇床上振荡 10 15 分钟 置于冰上后 取出 5l 裂解液 加入发光管中 可以马上上机检测 可以马 上上机 或放入 80C 保存 1 4 luciferase 分析 参见 promega 公司的 TECHNICAL MANUAL 上机操作方法附在后面 1 5 Western blot 检测待检基因的表达情况 见后 2 p53 报告基因检测系统 P53 抑制系统 p53 刺激系统仍在优化之中 因此主要介绍 p53 抑制系统的操作步骤 2 1 细胞培养及铺板 1 细胞株及材料 细胞株 Saos p53 细胞骨肉瘤细胞 Osteosarcoma cell 缺失 p53 基因 培养基 DMEM 10 FBS GBICO DMEM 无血清 培养器皿 75cm2 培养瓶 24 孔细胞培养板 2 细胞培养及铺板 a 传代 用 DMEM 10 FBS 培养基接种 Saos 至 75cm2 培养瓶 细胞长满后铺板并 传代 一瓶 75cm2 的细胞长满约为 1107 个 b 铺板 细胞消化 将培养好的 Saos 细胞 75cm2 培养瓶 倾去培养基 加入 2ml 胰酶轻 轻摇晃以覆盖整瓶细胞 37 培养箱放置 2 3min 观察细胞从瓶壁上脱落下来 也可以用手拍击瓶壁 显微镜下观测到细胞成单个 或是只有 2 3 个细胞聚团 即可以加入含有血清的 DMEM 10 FBS 10 ml 左右 终止胰酶的消化作用 细胞计数 如果细胞密度较大 可按一定倍数稀释后计数 细胞密度 单位 个 ml 4 个大方格的细胞总数 4 104 稀释倍数 铺板 24 孔板的细胞接种量为每孔 1 0105 个 接种体积为 500l 来铺板 细胞加入后将 24 孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动 勿转动 使细胞 能够均匀分布 放置细胞培养箱生长 2 2 转染 1 试剂及材料 转染试剂 Lipofectamin 2000 质粒 a 对照质粒 pEF BOS P53 wild type plasmid b P53 luc report plasmid c 目的基因质粒 构建在 pEF FN 载体上 2 转染 铺板后 24 小时转染 每个样品须作 3 个重复孔 目的是为消除实验误差 并且在 24 孔板上相应位置做好标记 在 a b 两个 eppendorf 管中分别加入 a 0 1g P53 luc reporter gene 0 4g interest gene 25ng P53 wild type plasmid serum free DMEM 至终体积 50l 孔 negative cotrol 不加 P53 wild type plasmid b 1 5L lipofectamine 2000 48 5L serum free DMEM 体积为 50l 孔 室温放 置 5min a b 二者混合 室温放置 20 30min 后将混合液缓慢而均匀的加到 24 孔板细胞液 中 每孔为 100l 轻轻摇晃 使 DNA 分布均匀 培养 24hr P53 抑制系统 negative cotrol pEF BOS positive control pEF BOS P53 wild type plasmid 进一步具体转染方法可以参照 Lipofectamin2000 的说明书 2 3 细胞收获及处理 Buffer 5 PBL 裂解液 Tricine pH7 8 40 mM NaCL 50 mM EDTA 2 mM MaSO4 1 mM DTT 5 mM Triton X 100 1 1 转染后 24 小时先通过荧光显微镜观察 GFP 表达的强弱以判断转染效率 2 细胞处理 吸干培养液 24 孔板中每孔加入 1 PBL buffer 室温下摇床上振 荡 10 15 分钟 置于冰上 取出 5L 裂解液 加入发光管中 可以马上上机检测 或 放入 80C 保存 2 4 luciferase 分析 上机操作方法附在后面 2 5 Western blot 检测待检基因的表达情况 操作附在后面 3 NFAT 报告基因检测系统 NFAT 刺激系统 NFAT 抑制系统 3 1 细胞培养 1 细胞株及材料 细胞株 Jurkat T 细胞 培养基 RPMI 1640 10 FBS GBICO 1 双抗 RPMI 1640 无血清 培养器皿 75cm2 培养瓶 175cm2 培养瓶 25 cm2 培养瓶 96 孔细胞培养板 2 Jurkat T 细胞的培养 Jurkat T 细胞为悬浮细胞 细胞活力好时 镜检多为 10 20 个细胞聚团 少游离 的单个细胞 细胞圆而透亮 一般培养按密度来计算 起始培养密度不要低于 1105 个 ml 24hr 后细胞密度即可达到 2105 个 ml 以此类推在第五天上即可 以达到 1 6106 个 ml 根据这个来调整接种密度及传代天数 最好细胞的密度高 不能超过 1 6106 个 ml 例如 起始培养密度 2105 个 ml 体积 30 ml 在第三天时 细胞密度达到 8105 个 ml 细胞总数达到 2 4107 个 因为检测一个待检基因的电击所需细胞数量为 1107 所以 此培养的细胞数只能做 2 4 个样品 因此 根据实验所需要检测的样 品数目来调整培养细胞的体积 象 175cm2 的培养瓶可以培养 200 250ml 细胞总 数可以达到 16 20107 这样就可以电击 16 20 个样品 3 2 电击转化 细胞总数达到检测样品所需则可转染 转染用品 电击仪 400mm 电击杯 Biorad 1652088 质粒 a 对照质粒 NFAT 刺激系统 negative control pEF BOS posivie control SYC plasmid NFAT 抑制系统 negative control pEF BOS posivie control SLIM plasmid b NFAT luc report plasmid c 目的基因质粒 构建在 pEF FN 载体上 试剂 台盼蓝 0 4 用于活细胞计数 1 将 Jurkat T 细胞转到 50ml 离心管中 细胞计数 细胞密度最好在 1106 左右 2 1000rpm 离心 用无血清的 RPMI1640 培养液收集细胞 调整浓度为 2 5107 ml 每 个电极杯中加入 400l 细胞液 细胞数为 1107 个 3 依次加入 10g NFAT luc reporter gene 和 20ug interest gene 体积控制在 20l 以内 使质粒和细胞混匀 尽量不要有 bubble NFAT luc reporter gene 是每个电击杯都必须加的可以先在加到电击杯之前预先和细胞混好 4 电击条件 250V 950F 电击前轻轻弹击电击杯 将杯底的细胞重悬起来 注意不 要产生气泡 电击时观察一下 time constant 约为 24ms 5 电击完后立即弹击电击杯的侧壁数次 室温下放置 30min 6 将电极杯中的细胞加到 10ml RPMI1640 培养液中 含 serum 24cm2 培养瓶 培 养 40hr 即培养到第三天上午 3 3 铺板 加药 C305 1 60 稀释使用 PMA 储存浓度为 0 5mg ml 应用浓度为 50ng ml 稀释 10000 倍 Ionomycin 储存浓度为 1mM 应用浓度为 1M 稀释 1000 倍 详见附 1 1 将转染培养 40hr 后的细胞转到 15ml 离心管中 进行活细胞计数 台盼蓝染色 离心收细胞 调整细胞浓度为 2106 个 ml 2 在 96 孔板中 每孔加 50l 细胞 细胞数为 1105 个 每个样品还是要做 3 个复 孔 NFAT 刺激系统 NFAT 抑制系统可以同时进行 前者无需加药刺激 后者需要做 C305 抗体刺激和 PMA Ionomycin 刺激 因此 一个样品需要做 9 个复孔 按顺序 在 96 孔板中加入细胞 并相应做好标记 3 对于 NFAT 刺激系统 直接在每孔中补加 50l 新鲜培养基 使终体积为 100l 对于 NFAT 抑制系统分别加入 50l C305 anti TCR 60 倍稀释 或 50l PMA 50ng ml Ionomycin 1M 刺激 8 12 小时 3 4 细胞收获及处理 试剂 5 PBL 裂解液 同前 将刺激 8 12 小时后的细胞取出 每孔加入 25L 5PBL buffer 将细胞置于 80C 保 存 准备第二天检测 3 5 Luciferase 检测 将细胞培养板取出 37C 放置 10 15min 将裂解液融化 显微镜下确认细胞已完全 裂解 取出 5L 裂解液置于发光管中 上机检测 3 6 Western blot 检测待检基因的表达情况 见下 4 Western blot 试剂 Flag antibody 1 4000 goat anti mouse HRP Pierces 显色底物 取剩余细胞裂解液加入 SDS Loading buffer 裂解液与 SDS Loading buffer 比例视蛋白浓度而定 一般 293 T 细胞裂解液按 1 1 加入 2SDS Loading buffer Jurkat T 和 Saos 细胞裂解液按 6 1 加入 6 SDS Loading buffer 100 加热变性 5 10 分钟 上样 聚丙烯酰胺蛋白胶浓度为 10 75V 125V 一般 Jurkat T 和 Saos 细胞上样量为 20l 293 T 细胞为 8l 电泳 根据所要分离的蛋白质分子量大小 配制适当浓度的 SDS PAGE 胶 常用浓 度为 10 20 转膜 湿转 在一适当容器中加入转移缓冲液 将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和 4 张普通 滤纸浸泡约 10min 若用 PVDF 膜 则首先要将 PVDF 膜置于甲醇中浸透 10min 然 后和硝酸纤维素膜同样使用 依次将 2 张滤纸 SDS PAGE 胶 膜 2 张滤纸叠放在一起 对齐并赶出其中的气泡 将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中 胶在阴极 接通电源 在 4 冰浴中进行转膜 恒流 300 毫安 或恒压 100 伏 转膜 1hr 或恒 压 30 伏转膜过夜 B 半干转 在一适当容器中加入转移缓冲液 将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和 2 张约 3mm 厚滤纸浸泡约 10min 依次将 1 张滤纸 SDS PAGE 胶 膜 1 张滤纸叠放在一起 对齐并赶出其中的气泡 将膜靠近阳极 底部 装入转膜仪中 膜在下 胶在上 接通电源 恒流 0 8 毫安 cm2 膜 转膜 1 5hrs 杂交 以下各步均置于摇床上进行 a 将转好的膜浸于 5 脱脂奶中封闭 30min b 将膜浸于含有一抗 终浓度为 1 g ml 的 TBST 中室温 1hr c 用 TBST 将膜浸洗 3 次 至少 10min 次 d 将膜浸于含有二抗的 TBST 中室温 30min e 用 TBST 将膜浸洗 3 次 10min 次 膜即可用于显色反应 若使用偶联酶标抗体 例如 anti flag HRP 则在牛奶封闭后 将膜浸于含有抗 体的 TBST 中 1hr 然后用 TBST 将膜浸洗 3 次 10min 次 膜即可用于显色反应 显色 目前主要使用 PIERCE 试剂盒显色 将膜表面的液体略微沥干 置于干净的保鲜膜上 将等体积的底物 1 和底物 2 混合 通常用量为 10 l cm cm 膜 后 均匀覆盖 于膜的表面 避光放置 3 5min 将膜表面的液体略微沥干后 用干净的保鲜膜包裹 固定于暗盒中即可压 X 光片 压片时间可适当调节 显影 定影 分析结果 膜的 strip 膜经 Strip 后可继续用于另一次 western blot 实验 将膜浸于 stripping buffer 中 50 放置 30min 最好放在通风柜中 用 TBST 浸洗膜 2 次 每次置于摇床上 10min 5 脱脂奶粉封闭 30 分钟 相关试剂 5 SDS PAGE 电泳缓冲液 Tris 碱 15 1g 甘氨酸 94g SDS 5g 加水定容至 1000ml 转膜缓冲液 Tris 碱 4 55g 甘氨酸 21 625g 甲醇 200ml 加水定容至 1000ml TBST 1 TBS 0 1 Tween 20 Stripping buffer 100ml 巯基乙醇 700ul 2 SDS 2g 62 5mM Tris HCl 0 76g pH6 7 5 注释 5 1 几种药物的储存浓度和应用浓度 TNF 1106U 瓶 1mg 4107U 1106U 25g 溶于 12 5ml PBS 中 浓度为 2g ml 储存浓度 2g ml 100l 分装 存于 40 应用浓度 20ng ml 稀释 100 倍 C305 60 倍稀释使用 C305 原液分装存于 80 稀释后存于 20 短期 不超于 一周 可放置 4 并加入少量 NaN3 无菌操作 PMA and Ionomycin dissolved in DMSO PMA 1 支 1mg 溶于 2ml DMSO 即 0 5mg ml 储存浓度 0 5mg ml 3l 分装 储存于 80C 应用浓度 50ng ml 稀释 10000 倍 Ionomycin 1mg 747 1 MW 1 3310 3mmol 溶于 1 33ml 浓度为 1mM 储存于 80C 储存浓度 1mM 6l 分装 应用浓度 1M 稀释 1000 倍 各系统的 control NF kB 刺激系统 TRAF6 与 NFkB reporter gene 共转染 作为 positive control NF kB 抑制系统 Dominant negative TRAF6 与 NFkB reporter gene 共转染 抑 制 TNF 诱导的 NFkB 活性 p53 抑制系统 wt P53 与 p53 luc 共转染 作为 positive control NFAT 刺激系统 SYK 与 NFAT luc 共转染 作为 positive control NFAT 抑制系统 SLIM 与 NFAT luc 共转染 抑制 C305 诱导的 NFAT 活性 作为 positive control 5 3 Lumat LB P507 仪器操作步骤 开机 和注入反应底物 a 开机后 仪器的液晶屏出现 b 选择 OTHERS 选项 进入子菜单 c 选择 OP