酵母细胞分批培养 实验

酵母菌分批发酵试验酵母菌分批发酵试验 一 实验目的一 实验目的 1 学习酵母菌的发酵方法及其发酵过程的优化控制技术 2 学习和掌握分批发酵一般过程和操作规程 二 实验原理二 实验原理 酿酒酵母是一种食品级的微生物 人类从几千年前就开始利用它了 像夏 禹时期就有仪狄作酒的记载 干酵母蛋白质含量高达 45 且其蛋白氨基酸品 种齐全 维生素丰富 营养价值较高 是饲料工业 医药工业 发酵工业和食 品工业的重要原料 早在 1900 年时 面包酵母已经形成大生产的规模 作为人 类食物的酵母生产 则是在第一次世界大战时在德国发展起来的 酵母单细胞 蛋白一直是欧美市场上缺乏的蛋白质资源 国内也很匮乏 本实验在发酵工程课堂教学理论基础上 以分批发酵法制备酿酒酵母细胞 为实践内容 深入理解发酵原理 方法以及过程及其优化控制方法 通过实践 与理论的结合 加深对发酵工程的认识 进一步增进专业能力和素养 发酵工程实验日程表发酵工程实验日程表 序号序号实验项目实验项目时间时间实验内容安排实验内容安排 1 培养基制培养基制 备与灭菌备与灭菌 预计 4 学 时 1 固体培养基配制 500ml 组 分装 2 瓶 2 培养皿清洗及包扎 15 副 组 无菌水 100ml 瓶 3 吸管包扎 4 支 组 4 液体培养基制备 800ml 组 分装 16 瓶 灭菌 0 1MPa 20min 2 酵母菌种酵母菌种 活化与种活化与种 子制子制 预计 2 学 时 1 菌种的分离纯化 超净工作台消毒 UV 照射 20min 75 乙醇擦拭台面 活性酵母菌粉 无菌水溶解 稀释 10 2倍 涡旋震荡 5min 倒平板 10 副 平皿 组 平板划线分离 30 倒置培养 2 接种准备工作 超净工作台消毒 UV 照射 20min 75 乙醇擦拭台面 1 种子培养接种 平板单一菌落 种子培养基 2 环 瓶 涡旋震荡 3 5min 2 摇瓶培养 摇床设置及调节 30 200r m 摇瓶固定 启动培养 3 发酵罐结发酵罐结 构 操作构 操作 规程及酵规程及酵 母菌分批母菌分批 发酵发酵 预计 8 学 时 1 发酵培养基配制 18L 2 发酵罐操作培训 发酵罐初始状态检查及调节 清洗 清水冲洗 2 3 遍 发酵罐运行启动 发酵罐运行参数设置 空罐灭菌 0 15MPa 20min 进料 实罐灭菌 0 1MPa 维持 30min 冷却 火焰封口接种 发酵参数稳定状态调节与维持 3 发酵取样 取样管灭菌 取样 再灭菌 4 发酵中间过程分析 0 hour pH 测定 pH 计 or 精密试纸 酸度 中和法 残糖测定 折光法 菌体浓度测定 A600光密度法 5 中间取样 每间隔 4h 取样管灭菌 取样 再灭菌 共计 4 6 次 4 酵母菌的酵母菌的 形态观察 形态观察 酵母细胞酵母细胞 的分离提的分离提 取取 预计 6 学 时 1 水浸片制作及观察 2 酵母菌分离条件试验 3 发酵结束工作 器皿 设备还原 环境清洁 实验一实验一 培养基制备与灭菌培养基制备与灭菌 1 实验原理实验原理 培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比 例配制的多种营养物质的混合物 一个完整的培养基配方组成包括组成成分 各组成成分的浓度和合适的 pH 培养基的组成成分主要有碳源 氮源 无机盐 和微量元素 水 生长因子以及特殊用途的前体和诱导物 实验利用葡萄糖 蛋白胨 酵母抽提物组成的培养基分批发酵培养酵母菌 灭菌是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子 或从中将其 除去 绝大多数工业发酵是需氧的纯种发酵 因此所使用的培养基须彻底灭菌 本实验采用 121 30min 的湿热灭菌法来对培养基进行灭菌处理 2 仪器 材料和试剂仪器 材料和试剂 1 仪器 电子天平 高压灭菌锅 2 材料 蛋白胨 酵母抽提物 葡萄糖 去离子水 pH 试纸 NaOH HCl 100mL 三 角瓶 250mL 三角瓶 瓶塞 玻璃棒 称量纸 100mL 量筒 500mL 烧杯 培养皿 3 试剂 固体平板培养基 葡萄糖 2 蛋白胨 2 酵母抽提物 1 琼脂 2 液体培养基 葡萄糖 2 蛋白胨 2 酵母抽提物 1 3 实验步骤实验步骤 1 计算 按固体培养基和液体培养基的配方 计算 500mL 固体培养基和 800mL 液体培养基各物质的用量 2 称药品 用砝码天平准确称量各物质 3 溶解 将培养基的组分放加在 500mL 烧杯的水中 玻璃棒搅拌溶解 固体培养基琼脂在室温下不能溶解 需加热煮化 4 分装 液体培养基每组按 50L 培养基 250mL 三角瓶规格分装 16 瓶 固体培养基分装 250mL 培养基 250mL 三角瓶 5 包扎 三角瓶口塞上瓶塞后用牛皮纸和线绳包扎 以防灭菌时冷凝水 沾湿棉塞 在纸上写上培养基名称 组别 日期 6 灭菌 放置于高压蒸汽灭菌锅内 121 湿热灭菌 30min 7 倒平板 待高压蒸汽灭菌锅降温至 60 时 取出培养基 液体培养 基室温放置 固体培养基在已紫外灭菌的超净工作台里倒制 5 10 只平板 实验注意事项实验注意事项 1 准确称量各物质 称完药品应及时盖紧瓶盖 2 调 pH 值时要小心操作 避免回调 3 不同培养基各有配制特点 要注意具体操作 4 灭菌操作中务必待压力下降到零后 才可打开锅盖 实验二实验二 酵母菌种活化与种子制备酵母菌种活化与种子制备 1 实验原理实验原理 菌种活化是指将保存在砂土管 冷冻干燥管 冷冻斜面中处于休眠状态的 生产菌种接入试管斜面或平板培养基进行复苏处理 活化后 再经过扁瓶或摇 瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种 这些纯种培养物称为 发酵的种子 种子的一般制备过程可用下图表示 2 2 仪器 材料和试剂 仪器 材料和试剂 1 仪器 恒温培养箱 超净工作台 恒温摇床 2 材料 酿酒酵母菌种 接种环 3 试剂 固体培养基 液体培养基 3 实验步骤实验步骤 1 超净工作台灭菌 打开紫外灯 照射 30min 完毕后打开风机吹 5min 2 准备工作 将酵母菌种和培养基平板放在超净工作台中 点燃酒精灯 用 75 的酒精棉球擦拭双手 3 灼烧接种环 将接种环在酒精灯外焰上来回移动着灼烧 其中螺旋接头 部分多烧一会儿 接种环烧至红热状态后 移离火焰冷却 4 划线法分离 接种环挑取少量酵母菌 左手拿培养基平板在酒精灯火焰 旁打开 接种环在平板表面分三次作 之 字形划线 每次划线后要烧接种环 再从上一次划痕的尾部拉出后划下一区 依次划成 4 个区 5 菌落培养 将划线接种的平板倒置于 30 培养箱中培养 24h 观察菌 落的大小 颜色 形状 6 单菌落接种 在超净工作台中 注意无菌操作 将 50mL 培养基 250mL 三角瓶的瓶口连同瓶塞在酒精灯火焰上旋转灼烧片刻后取下棉塞 用灼烧过的接种环挑取一个酵母单菌落 伸入液体培养基中振荡几下 取 出在火焰上灼烧 再将瓶塞塞好 再依次完成另外三瓶 50mL 培养基 250mL 三角瓶的接种操作 7 标记 在接种的三解瓶壁上贴上标签 注明菌种名称 操作人 日期 8 种子培养 将接种后的培养基置于 30 摇床中 200rpm 振荡培养约 12h 实验注意事项实验注意事项 1 整个实验过程要严格无菌操作 2 标记时请写明操作者的姓名 方便查找和整理 提高效率 3 划线及接种完后要将接种环在火焰上灼烧 以杀死残留的酵母菌 实验三实验三 发酵罐结构及使用操作规程发酵罐结构及使用操作规程 1 1 实验目的 实验目的 熟悉发酵罐基本结构 了解发酵罐工作原理 学会发酵罐使用方法 2 2 实验内容 实验内容 1 1 发酵罐基本结构组成 发酵罐基本结构组成 1 罐体系统 罐体 夹套 搅拌器 挡板 进料口 接种口 放料口 排气管 进气管 取样管 照明灯等 2 灭菌系统 蒸汽发生器 蒸汽分配管 夹套加热装置 放料口灭菌装 置 通气管取样管灭菌装置 空气过滤系统灭菌装置 3 温度控制系统 罐内温度传感器 电极 水箱温度传感器 电极 恒温水箱 恒温水循环管路 4 无菌空气制备系统 空气压缩机 气液分离器 气体流量计 气流调 节器 空气过滤器 2 级 5 控制系统 电源开关 操作显示屏 控制器触摸开关 参数设置转换 调节屏 发酵罐外形图发酵罐外形图 2 发酵罐操作规程发酵罐操作规程 1 发酵罐工艺操作条件 温度 25 40 压力 0 0 3MPa 表压 灭菌条件 温度 100 140 压力 0 0 3MPa 表压 pH 2 11 需氧量 0 05 0 3 kmo1 m3 h 通气量 0 3 2 V V M 功率消耗 0 5 4kW m3 发酵热量 5 000 20 000 kcal m3 h 2 清洗工作 清洗前应取出 pH DO 电极 清洗罐内可配合进水 进气 电机搅拌 加 温一起进行 清洗后安装要注意罐内密封圈 硅胶垫就位情况 注意罐与罐 座间隙均衡 3 试车 将电极 电机 电缆 进出气软管 冷凝器进出水接头安装就位 安装 完毕后要对罐体内通气 0 2MPa 作密封性试验 方法如下 关闭 阀门 旋紧罐体上每一个接口 堵头 电极紧固帽 打开空压机 调节气阀 使罐 压保持 0 2MPa 左右 对系统进行 2 3 小时试运行 如有问题作相应处理后 方可正式使用 4 发酵罐使用操作规程 如果短期内需再次培养发酵 应对其进行 2 3 次清水清洗待用 如准备 长期停用 则应对其进行灭菌 然后放去水箱与罐内存水 放松罐盖紧固螺 丝 取出电极保养储存好 将罐 各管道余水放净 关闭所有阀门 电源 盖上防尘罩 发酵罐操作开始前 先关闭所有出料口 取样口 进气口 打 开出气阀 加入发酵培养基 装注完成后旋紧进料口螺盖 灭菌 启动蒸汽发生器 待气压达到 0 2Mpa 以上时 a 开启发酵罐出气阀 开启高压蒸汽阀将高压蒸汽通过进气阀引入夹套 打开夹套排水阀 排 除蒸汽 冷凝水 控制阀门开量 保持微弱出汽 b 同时通过蒸汽分配管将蒸汽引入空气过滤系统 注意 蒸汽引入前关闭 通向电器控制柜的空气阀门 使蒸汽通过一级和二级空气过滤器并顺利进入 取样口出口 保持取样放出口微弱出汽 c 另一路蒸汽通过蒸汽阀发酵罐放料口 并保持放料口微弱出汽 d 等到罐内培养基温度达到 80 时 开启与罐直接相连的通气阀 将高压 蒸汽直接接入罐内加热培养基 并对与罐相连的管道灭菌 e 直到罐内培养基开始沸腾后 关闭排气阀 使罐内升压至 0 1Mpa 或灭 菌温度 121 维持温度 0 5 1 0 小时 关闭蒸汽进气阀 开启冷却水管路系统 通过夹套冷却发酵培养基 当罐 内压力接近常压前向罐内通入无菌空气 保持罐内空气压力 0 03MPa 上下 至发酵温度关闭冷却水系统 启动空气压缩机 开启进气阀 使压缩空气通过旋风分离器及空气过滤器 从进气阀进入发酵罐 使溶解氧浓度达到发酵初始水平 接种 接种方法可采用火焰接种法或差压接种法 a 火焰接种法 在接种口用酒精火圈消毒 然后打开接种口盖 迅速将接 种液倒入罐内 在把盖拧紧 b 差压法 在灭菌前放入垫片 接种时把接种口盖打开 先倒入一定量的 酒精消毒 待片刻后把种液瓶的针头插入接种口的垫片 利用罐内压力和种液 瓶内的压力差 将种液引入罐内 拧紧盖子 发酵状态调节 a 罐压 发酵过程中须手动控制罐压 即用出口阀控制罐内压力 调节空气 流量的 须同时调节出口阀 应保持罐内压力恒定大于 0 03Mpa b 溶解氧 DO 的测量和控制 溶解氧的标定 在接种前 在恒定的发酵温度下 将转速及空气量开到最 大值时的溶解氧 DO 值作为 100 发酵过程的溶解氧 DO 测量和控制 DO 的控制可采用调节空气流量和调节 转速来达到 最简单是转速和溶氧的关联控制 其次则必须同时调节进气量 手动 控制 有时需要通入纯氧 如在某些基因工程菌的高密度培养中 才 能达到要求的 DO 值 c pH 的测量与控制 pH 值的校正 在灭菌前应对 pH 电极进行 PH 值的校正 在发酵过程中 PH 值的控制使用蠕动泵的加酸加碱来达到的 酸瓶或碱瓶须 先在灭菌锅中灭菌 旋松进料口螺旋盖 在进料口环槽中加入适量酒精棉 点 燃酒精 打开进料口螺旋盖 将种子三角瓶菌液接入发酵罐 搅拌均匀后 开 始发酵控制 d 间隔 8 h 开启取样阀取样 300 500ml 发酵液分别测定残糖 菌浓 酸 度等数值 发酵参数到达放罐指标时 发酵结束 打开放料阀 将发酵液全部排出 放罐后用水清洗发酵罐 2 3 次 洗净后通蒸汽消毒 15min 培养后用干净 抹布要清除电器箱 电缆等接头和其他罐体部件上的物体 实验四实验四 酵母菌分批发酵酵母菌分批发酵 1 实验原理实验原理 发酵过程即细胞的生物反应过程 是指由生长繁殖的细胞所引起的生物反 应过程 微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能 而且要赋以合适 的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来 为此我们必须通过各种研究方 法了解有关生产菌种对环境条件的要求 如培养基 培养温度 pH 氧的需求 等 并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途 径 为设计合理的生产工艺提供理论基础 同时 为了掌握菌种在发酵过程中 的代谢变化规律 可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度 糖 氮消耗及产物浓度 以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度 pH 溶解氧 等参数的情况 并予以有效地控制 使生产菌种处于产物合成的优化环境之中 2 仪器 材料和试剂仪器 材料和试剂 1 仪器 30L 机械搅拌通气式发酵罐 恒温摇床 显微镜 分光光度计 2 材料 酿酒酵母种子 移液管 载玻片和盖玻片 3 培养基 酵母分批发酵培养基 蔗糖 5 蛋白胨 1 硫酸铵 0 4 KH2HPO4 0 5 MgSO4 7H20 0 2 消泡剂 0 2ml l pH5 5 3 实验步骤实验步骤 酵母菌发酵过程 操作规程见实验三 30 升发酵罐装入 20 升发酵培养基 121 灭菌 30 40min 冷却至 30 将培养好的摇瓶种子接入发酵罐 接种量 1 5 进行发酵 发酵条件为 温度 30 搅拌转速 250 300rpm 通风量 1 0 5 v v m 过程检测与监控 0 小时 取样测定 pH 酸度 光密度 OD 和还原糖 4 24 小时 每隔 4h 取样测定 pH 酸度 光密度 OD 和还原糖 4 4 实验报告内容和数据处理 实验报告内容和数据处理 根据发酵过程酵母浓度 pH 酸度和还原糖的变化规律 作出相关参数指 标随时间变化的曲线图 形态观察见实验五 生物量测定 利用分光光度计 测 600nm 处酵母细胞的吸光值 可间接地反映细胞的多少 测 OD 值时 要迅速 尽量避免细胞沉降所引起的误差 实验五实验五 酵母菌的形态观察酵母菌的形态观察 1 实验原理实验原理 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物 其大小通常比常见细菌大几倍或几 十倍 大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖 有的分裂繁殖 有性繁殖是通过 接合产生子囊孢子 本试验通过美蓝染液水浸片合水 碘液水浸片来观察酵母 的形态和出芽生殖方式 美蓝是一种无毒性的染料 它的氧化型呈蓝色 还原 型无色 用美蓝对酵母的活细胞进行染色时 由于细胞的新陈代谢作用 细胞 内具有较强的还原能力 能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型 因此 具有还原能力的酵母活细胞是无色的 而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则 呈蓝色或淡蓝色 借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别 子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子 在酵母菌中 能否形 成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一 酵母菌形成子囊孢子 需要一定的条件 所以对不同种数的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基 麦氏 McClary 培养基 葡萄糖 醋酸钠培养基 有利于酿酒酵母子囊孢子的形 成 2 仪器 材料和试剂仪器 材料和试剂 1 仪器 显微镜 超净工作台 2 材料 吸耳球 50mL 小烧杯 玻璃棒 载玻片 盖玻片 擦镜纸 接种环 酒精 灯 3 试剂 0 05 和 0 1 吕氏碱性美蓝染色液 哥卢氏碘液 3 实验步骤实验步骤 美蓝浸片观察美蓝浸片观察 死活细胞的观察 1 在载玻片中央加一滴 0 1 吕氏碱性美蓝染色液 然后按无菌操作用接 种环挑取少量酵母菌放在染液中 混合均匀 2 用镊子取一块盖玻片 先将一边与菌液接触 然后慢慢将盖玻片放下使 其盖在菌液上 3 将制片放置 3min 后镜检 先用低背景然后用高倍镜观察酵母的形态和 出芽情况 并根据颜色来区别死活细胞 4 染色后约 0 5h 后再次进行观察 注意死细胞数量是否增加 5 用 0 05 吕氏碱性美蓝染液重复上述操作 6 对于发酵液中的酵母细胞 可以用无菌玻璃棒蘸取后直接制片观察 比 较固体培养和液体培养的酵母细胞形态有何异同 并绘图 水 碘液浸片观察水 碘液浸片观察 酵母菌细胞中肝糖粒的观