质粒DNA测定实验报告.doc

生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验日期2014-12-11实验地点第4实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1. 掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2. 掌握碱裂解法提取质粒的方法 3. 了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 4. 学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理（一）、第一部分 聚合酶链式反应1. PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。 1) 加热使模板DNA，在高温下90-95变性，双链解链；2) 降低溶液温度，使合成引物在低温（3570,一般低于模板Tm值的5左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；3) 溶液反应温度升至中温72，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。（二）、第二部分 质粒DNA提取与定量1.质粒（Plasmid）1) 独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；2) 存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。2.碱裂解法、1) 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；2) 高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；3) 当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。3.离心层析柱1) 硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；2) 通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3) 低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。4.紫外光吸收法1) 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应；2) 而且物质对光的吸收是具有选择性的；3) 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。4) 因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。（三）、第三部分 酶切鉴定1. 限制性内切酶1) 限制性内切酶（restriction endonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具；2) 特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA；3) 分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。（四）、第四部分 琼脂糖凝胶电泳1. 天然琼脂1) 天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80）及琼脂胶（Agaropectin）组成；2) 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷；3) 琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 2.基本原理1) 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；2) DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；3) DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。三、材料与方法：（一）实验材料1. 试剂1) 菌液：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD19-T)2) 引物： 正向： 5 GTAAAACGACGGCCAGT 3 反向: 5 CAGGAAACAGCTATGAC 33) 2Premix Taq： Taq酶：5U/l 4dNTP: 各10mmol/L10缓冲液（buffer）: 500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-HCl 4) 灭菌去离子水5) 含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH56) LB培养基（液体、固体）7) AXYGEN试剂盒质粒提取试剂盒（爱思进，中国）a) 溶液 P1（S1)b) 溶液 P2 (S2）c) 溶液 P3（S3）d) 去蛋白液 PE（W1)e) 漂洗液 WB(W2）f) 洗脱液 EB（Eluent)8) DNA Marker 9) 电泳缓冲液2. 仪器与器材1) PCR仪(BioRad MJ mini)2) 台式离心机3) 微量加样枪4) 灭菌的薄壁离心管5) 凝胶电泳系统6) 凝胶成像系统7) 恒温培养箱8) 恒温摇床9) 超净工作台10) 台式离心机11) 高压灭菌锅（二）方法与步骤部分方法步骤注意事项1)1.注意每换一种试剂换一个新吸头) 2.如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。用微量加样枪加试剂时，同种试剂可以不用换吸头，每次换一次不同试剂时要换一个新吸头。3.在PCR中，如果配好的反应液较多沾到管壁上，要将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后才将反应管放到基因扩增仪上。4.要根据质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求选择碱裂解法方法来提取质粒DNA。5.在提取质粒DNA时，菌液一定悬浮均匀，不能有结块。6.在质粒DNA提取的实验中，加入溶液S2时，时间不能太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次。7.在质粒DNA提取实验中，复性时间不能太长。8.在质粒DNA提取实验中，将上清液转移到吸附柱时，需小心谨慎，避免有蛋白质掺和进去，需用微量加样枪100ul或200ul分几次取。9.执比色皿时，应该拿着比色皿的粗糙面，不能触碰光滑面。空白对照比色测定和样品比色测定应该在同一比色皿中检测。1)10.在酶切反应中，酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。四、结果与讨论：1. 实验记录测量次数质粒DNA浓度 (g/ml)Ratio值(A260/A280)195.41.77295.51.78397.11.79平均值95. 71.782. 结果与计算 相关实验图片：3. 分析与讨论1) 图片分析a) 在图片三中，其他三类DNA与Maker相比较，可知质粒DNA的分子大小在2000bp3000bp，酶切反应的质粒DNA片段分子大小在3000bp左右，PCR的DNA分子大小在450bp。b) 预期PCR产物大小约400500bp，基本符合。2) 原因分析a) PCR颜色较浅，有可能与点样前操作失误相关。4. 复习与思考1) 碱法提质粒中溶液、的作用？溶液：葡萄糖悬浮细胞，EDTA鳌合金属离子使DNase失活。溶液：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS线性DNA沉淀，Na可中和DNA。2) 结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？a) 酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超