酪酸梭状芽孢杆菌.doc

I 摘 要 酪酸梭状芽孢杆菌 存在于人和畜禽肠道内 分类归属于梭菌属 为革兰氏阳 性厌氧杆菌 是一种益生菌 酪酸梭状芽孢杆菌作为微生态制剂 本身能形成内生 芽孢 具有耐高温 耐酸 耐胆盐 耐部分抗生素等特性 目前广泛应用于调理人 体肠胃的整肠类药品 能大幅降低肠炎的发病率 对菌群失调引起的腹泻 抗生素 相关的肠炎 便秘等均有良好疗效 且无任何毒副作用 此外酪酸梭状芽孢杆菌作 为兽药和饲料添加剂 比非芽孢类活菌制剂有显著的优势 由于酪酸梭状芽孢杆菌 制剂有以上的诸多优良特点 本论文采用酪酸梭状芽孢杆菌做为研究对象 与此同 时 随着环境保护要求的日趋严重 资源枯竭 节约资源迫在眉睫 为了节约电能 节约成本 避免用离心的方法沉降微生物 寻找酪酸梭状芽孢杆菌絮凝的最佳物质 最佳浓度有着重要及实际意义 本实验根据各种物质对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝机理不同 以寻找最适合的絮 凝剂 主要对比微生物自身沉降 三种不同的壳聚糖絮凝 生物絮凝制剂 硅藻土 沸石粉及碳酸钙对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果 采用梯度对比实验 进行单因素 浓度分析 通过絮凝后对上清液中活菌体浓度的来比较絮凝的效果 以优化出合适 的絮凝剂及其最适使用浓度 经过一系列的实验表明 壳聚糖 DAC 90 在其浓度为 0 1 时对酪酸梭状 芽孢杆菌的絮凝效果最好 代替离心沉降微生物的方法 并达到节约能源节约时间 人力的目的 关键词关键词 酪酸梭状芽孢杆菌 微生物絮凝 最适浓度 II Abstract Clostridium butyricum is a kind of probiotics It is Attributed to Clostridium a Gram positive anaerobic bacillus It can generate endogenous spore Clostridium butyricum has strong ability to resist high temperatures low pH and some antibiotics Clostridium butyricum is widely used in human health as gastrointestinal medicine It can significantly reduce the incidence of colitis caused by diarrhea antibiotic associated colitis constipation etc So this paper adopts the butyric acid clostridium as research object At the same time as the requirement of environmental protection has become increasingly serious resource depletion save resources is imminent In order to save power save costs avoid to use the method of centrifugal sedimentation microbes looking for butyric acid clostridium flocculation of best material the best concentration has important and practical significance This experiment according to various substances of butyric acid clostridium flocculation mechanism is different to find the most suitable flocculant Microbial subsidence of main contrast three different types of chitosan flocculation biological flocculating agents diatomite zeolite powder and calcium carbonate of butyric acid clostridium flocculation effect gradient is used to contrast experiment the concentration of single factor analysis through after flocculation of live bacteria concentration in the supernatant fluid to compare the effect of flocculation in order to optimize the suitable concentration of flocculating agent and its optimal use After a series of experiments showed that chitosan DAC 90 or higher in the concentration of butyric acid was 0 1 of clostridium flocculation effect is best instead of the microbial centrifugal sedimentation method and achieve energy conservation to save time and manpower Key words Clostridium butyricum Microbial flocculation The optimal concentration 目 录 序 言 1 第 1 章 实验材料 4 1 1 菌种来源 4 1 2 主要原材料 4 1 3 主要实验仪器 5 1 4 培养基 5 第 2 章 实验方法 6 2 1 培养方法 6 2 2 溶液的配制及浓度 6 2 3 检测方式 6 2 3 1 原始菌液 上清液中活菌数及芽孢数的检测方法 6 2 3 2 数据的处理 7 2 4 实验方法 7 2 4 1 壳聚糖 DAC 90 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 7 2 4 2 壳聚糖 DAC 85 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 7 2 4 3 水溶性壳聚糖对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 7 2 4 4 生物絮凝剂对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 8 2 4 5 硅藻土对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 8 2 4 6 沸石粉对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 8 2 4 7 碳酸钙对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 8 2 4 8 离心对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 9 2 4 9 絮凝剂的优化实验 9 第 3 章 结果与讨论 10 3 1 有机絮凝剂对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果 10 3 1 1 壳聚糖 DAC 90 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 10 3 1 2 壳聚糖 DAC 85 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 11 3 1 3 水溶性壳聚糖对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 12 3 1 4 生物絮凝剂对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 13 3 1 5 离心絮凝酪酸梭状芽孢杆菌 14 3 1 6 絮凝剂的优化 壳聚糖 DAC 90 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 14 3 2 无机絮凝剂对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果 15 3 2 1 硅藻土对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 15 3 2 2 沸石粉对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 16 3 2 3 碳酸钙对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 17 3 2 4 絮凝剂的优化 硅藻土对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 18 第 4 章 结论 20 参考文献 21 致 谢 22 1 序 言 1 酪酸梭状芽孢杆菌简介 酪酸梭状芽孢杆菌 Clostridium butyricum 即丁酸梭状芽孢杆菌 1933 年日本 千叶医科大学医学系 Kingi Miyairi 博士从人类的粪便中分离出酪酸梭状芽孢杆菌 Clostridium butyricum MIYAIRI 随后发现其具有极强的整肠功能 可以抑制肠道 中的致病菌 促进肠道内有益菌如双歧杆菌和乳酸菌的生长 酪酸梭状芽孢杆菌属于硬壁菌门 Firmicutes 梭菌纲 Clostridia 梭菌目 Clostridales 梭菌科 Clostridiaceae 梭菌属 Clostridium 1 它存在于土壤中 人和动 物肠道内 干酪及酸奶中 酪酸梭状芽孢杆菌是一种直或弯曲的革兰氏阳性厌氧内 生芽孢杆菌 后期培养物可变为革兰氏阴性杆菌 菌体灰白色 呈煎蛋样 中间隆 起 2 酪酸梭状芽孢杆菌在琼脂平板上形成白色或奶油色的小规则圆形菌落 不水 解明胶 不消化血清蛋白 能够发酵葡萄糖 乳糖 果糖 蔗糖等碳水化合物产生 酸 一个显著的特征是产生淀粉酶 能水解淀粉但不能水解纤维素 发酵产物主要 有酪酸 甲酸 乙酸 乙醇 丁醇 氢气 二氧化碳等 1999 年 2 月由联合国粮农组织 FAO 和世界卫生组织 WHO 联合召开的第 52 次 食品添加剂专家委员会强调指出酪酸梭状芽孢杆菌是人的正常肠道菌 此后 人们 广泛的关注和研究了酪酸梭菌的形态特征 生理特点 生化特点及其商业应用 另 外 NARITA 等人研究酪酸梭状芽孢杆菌对重金属的抗性 3 酪酸梭状芽孢杆菌的 非共生固氮能力也引起了人们的注意 4 1940 年 酪酸梭状芽孢杆菌在日本实现了商业化生产并被应用于临床 最初它 被用作整肠剂 广泛用于肠道菌群失调 急慢性腹泻 肠易激综合症 抗生素相关 性肠炎等疾病的治疗 取得了显著疗效 此后 它先后被作为处方药 非处方药 兽药 饲料添加剂 食品添加剂等广泛使用 在韩国 酪酸梭状芽孢杆菌也己经被 用于牛 猪及家禽的饲料添加剂 酪酸梭状芽孢杆菌能单独作为饲料添加剂使用 也能与乳酸菌 芽孢菌 双歧杆菌等益生菌复配使用 能增强其功效 5 酪酸梭状芽孢杆菌相关专利涉及的应用相当广泛 除了酪酸梭菌本身的分离培 养 规模化生产等专利外 有利用其预防和治疗人类或动物疾病方面的 例如治疗 肠道疾病 肝脏疾病 癌症等 有利用其作为保健品的专利 有利用其促进动物或 植物生长方面的专利 还有利用其生产氢气等能源开发方面的专利 可见 现在关 2 于酪酸梭状芽孢杆菌的研究正日益深入和广泛 其产品市场更是蓬勃发展 2 离心分离对微生物的回收 对于浓度较小 粒径较大 硬度较强的不溶物 可以采用过滤分离 但当固体 颗粒细小而难以过滤时 发酵液不易被过滤纯化 离心操作往显得十分有效 离心 分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异 在离心场中使不同密度的固体颗粒 加速沉降的分离过程 3 微生物絮凝剂对菌体的回收应用及前景 微生物絮凝剂 Microbial flocculant MBF 是一种天然生物高分子絮凝剂 由微生物产生并分泌到细胞外 是具有絮凝活性的微生物代谢产物 微生物絮凝剂 可使液体中不易降解的固体悬浮颗粒 菌体细胞及胶体粒子等发生凝聚 沉淀 是 具有生物分解性和安全性的高效 无毒 无二次污染的绿色水处理剂 目前广泛接 受的絮凝机理主要有吸附架桥 吸附 电中和 沉析物网捕等 6 8 罗平等研究证 明微生物絮凝剂的絮凝机理为在氢键作用下的 吸附架桥 机理模式 9 但是 由 于微生物絮凝剂的生产成本较高 发酵生产工艺还不成熟 其成分及絮凝效果稳定 性不够等原因 使得微生物絮凝剂的发展受到一定程度的限制 微生物絮凝剂以其 无可比拟的优越性彰显了广阔的发展前景 但到目前为止 相比于其他类型的絮凝 剂 微生物絮凝剂在实际工程中尚未得到广泛应用 10 4 壳聚糖对菌体的回收应用及前景 壳聚糖因具有许多优良的特性 广泛应用于食品 医药 农业 日化 水处理等 领域 11 对水处理方面的研究中 由于以活泼氨基代替了惰性基团乙酰胺基 壳聚糖 具有许多明显的性质 不但溶解性能大大提高 而且氨基能与许多有机试剂反应 发生 化学改性 从而赋予壳聚糖多种性能 壳聚糖对于活性污泥有很强的絮凝作用 能有 效地处理食品工业废水 沉淀废水中的悬浮物及微生物 12 壳聚糖及其衍生物作为一种天然高分子材料 因其独特的性能越来越受到诸多国 家的重视 其应用领域也在不断扩大 近年来 我国在这方面的研究也日趋活跃 但与 日本 美国等国家相比 还是有很大的差距 现在在研发方面还面临不少问题 我国海域辽阔 湖泊众多 蟹 虾资源非常丰富 所以壳聚糖是取之不尽的 壳聚 糖在全世界范围供不应求 主要生产国有美国 日本 德国 法国 印度 荷兰 挪 威和加拿大等 壳聚糖及其产品的市场潜力是巨大 因此壳聚糖产品的市场前景十 3 分可观 很有必要对其进行更深入 更全面的系统研究 需要尽早制定该行业的详 尽发展规则 并投入大量人力 物力进行开发与研究 使壳聚糖早日成为国民经济发 展的又一支柱产业 4 第1章 实验材料 1 1 菌种来源 酪酸梭状芽孢杆菌来源 本实验室提供 1 2 主要原材料 材料名称材料来源 葡萄糖国药集团化学试剂有限公司 酵母浸膏上海天鹅啤酒有限公司 酵母粉北京奥星生物技术有限公司 玉米淀粉沈阳惠成调料有限公司 大豆粉 辽阳博丰集团有限公司 硫酸镁 天津北方天医化学试剂厂 硫酸铵 国药集团化学试剂有限公司 磷酸氢二钾 汕头市西陇化学试剂有限公司 硫酸锰 国药集团化学试剂有限公司 氯化钠 天津红岩化学试剂厂 磷酸二氢钾 国药集团化学试剂有限公司 壳聚糖 DAC 90 济南海得贝海洋生物工程有限公司 壳聚糖 DAC 85 济南海得贝海洋生物工程有限公司 水溶性壳聚糖 济南海得贝海洋生物工程有限公司 生物絮凝剂 辽宁大学环境学院 硅藻土 市售 沸石粉 市售 碳酸钙 德兴市明缘化工材料有限公司 5 1 3 主要实验仪器 主要仪器厂家 电子精密天平上海民桥精密科学仪器有限公司 XSP 18 双目显微镜江南仪器厂 生物洁净工作台辽宁鑫洋实验装备有限公司 SHP 250 生化恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司 SP 75 分光光度计上海光谱仪器有限公司 TDL 5A 型离心机上海安亭科学仪器 灭菌锅上海申安医疗器械厂 干燥箱沈阳市医疗器械厂 SHA C 水浴恒温振荡箱江苏国华仪器厂 1 4 培养基 初始种子培养基 葡萄糖 1 酵母粉 0 5 酵母浸膏 0 3 氯化钠 0 2 硫 酸镁 0 05 发酵培养基 葡萄糖 0 5 大豆粉 1 玉米淀粉 1 硫酸镁 0 05 氯化钠 0 2 硫酸锰 0 02 硫酸铵 0 1 磷酸二氢钾 0 2 磷酸氢二钾 0 15 13 6 第 2 章 实验方法 2 1 培养方法 种子培养的方法 种子培养基调节 pH 至 7 0 灭菌后趁热接种 待菌体培养至 18 22 小时进行转接 发酵培养的方法 将处于对数期的种子液 以 5 接种到发酵培养基中进行培养 恒温培养箱中培养 36 小时即可取出配用 2 2 溶液的配制及浓度 因每种物质的溶解性不同 所采用的配制方式也不同 水溶性壳聚糖即使用蒸 馏水配制溶解 水不溶性壳聚糖采用盐酸溶解 硅藻土 沸石粉和石灰均采用蒸馏 水来配制成悬浊液以供使用 壳聚糖 DAC 90 配制 取 0 5 克壳聚糖加入 25ml10 的盐酸将其溶解 并加入 25ml 蒸馏水 配制成浓度为 1 的壳聚糖溶液 壳聚糖 DAC 85 配制 取 0 2 克壳聚糖加入 10ml10 的盐酸 并加入 10ml 蒸馏 水 将盛有壳聚糖的烧杯放入水浴恒温振荡箱中进行溶解 配制成浓度为 1 的壳聚 糖溶液 水溶性壳聚糖配制 取 0 3 克壳聚糖加入 30ml 蒸馏水溶解 配制成浓度为 1 的壳 聚糖溶液 硅藻土配制 取 0 5 克硅藻土加入 10ml 蒸馏水进行溶解 配制成浓度为 5 的硅藻土 溶液 沸石粉配制 取 0 5 克沸石粉加入 10ml 蒸馏水进行溶解 配制成浓度为 5 的沸石粉 溶液 碳酸钙配制 取 1 克碳酸钙加入 10ml 蒸馏水进行溶解 配制成浓度为 10 的碳酸钙 溶液 2 3 检测方法 2 3 1 原始菌液 上清液中活菌数及芽孢数的检测方法 细菌个数测定采用血球计数法 在显微镜下进行观察计数 首先测得原始菌液 的菌个数及芽孢数 即吸取 0 1ml 的原始菌液于试管中 加入 10ml 蒸馏水混匀 相 当于将原始菌液稀释 100 倍 用滴管吸取并滴在血球计数板上 静止 5 分钟 在显 微镜下观察 数出原始菌液的菌个数及芽孢数 7 从每个试管吸取 0 1ml 上清液于小试管中 加入 2ml 蒸馏水混均 相当于将上 清液稀释 20 倍 用滴管滴在血球计数板上 静止 5 分钟 在显微镜下观察 数出 上清液菌数及芽孢数 2 32 数据的处理 芽孢回收率的计算 芽孢回收率 1 絮凝后上清液的芽孢数 原始菌液的芽孢数 100 沉降率的计算 菌体回收率 1 絮凝后上清液的菌个数 原始菌液的菌个数 100 2 4 实验方法 2 4 1 壳聚糖 DAC 90 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 取出八支试管 每支试管加入 20ml 菌液 将八支试管标号 1 8 号 分别加入 0 1 2 3 4 5 7 10ml 壳聚糖溶液 此时每支试管中的壳聚糖浓度分别为 0 0 05 0 1 0 15 0 2 0 25 0 35 0 5 盖好试管塞后上下摇晃均 匀 静止并开始计时 30 分钟后 按以上检测方法测得上清液活菌数及芽孢数 待 60 分钟后重复此 实验步骤 记录实验数据 并测得原始菌液中活菌数及芽孢数 以此计算出芽孢回 收率 菌体浓度及菌体回收率 2 4 2 壳聚糖 DAC 85 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 取出四支试管 每支试管加入 20ml 菌液 将四支试管标号 1 4 号 分别加入 0 5 1 2 4ml 壳聚糖溶液 此时每支试管中的壳聚糖浓度分别为 0 025 0 05 0 1 0 2 盖好试管塞后上下摇晃均匀 静止并开始计时 30 分钟后 按以上检测方法测得上清液活菌数及芽孢数 待 60 分钟后重复此 实验步骤 记录实验数据 并测得原始菌液中活菌数及芽孢数 以此计算出芽孢回 收率 菌体浓度及菌体回收率 2 4 3 水溶性壳聚糖对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 取出六支试管 每支试管加入 20ml 菌液 将六支试管标号 1 6 号 分别加入 1 2 3 4 5 6ml 壳聚糖溶液 此时每支试管中的壳聚糖浓度分别为 0 05 0 1 0 15 0 2 0 25 0 3 盖好试管塞后上下摇晃均匀 静止并开 8 始计时 30 分钟后 按以上检测方法测得上清液活菌数及芽孢数 待 60 分钟后重复此 实验步骤 记录实验数据 并测得原始菌液中活菌数及芽孢数 以此计算出芽孢回 收率 菌体浓度及菌体回收率 2 4 4 生物絮凝剂对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 取出四支试管 每支试管加入 20ml 菌液 将四支试管标号 1 4 号 分别加入 0 5 1 3 5ml 生物絮凝剂 此时每支试管中的壳聚糖浓度分别为 2 5 5 15 25 盖好试管塞后上下摇晃均匀 静止并开始计时 30 分钟后 按以上检测方法测得上清液活菌数及芽孢数 待 60 分钟后重复此 实验步骤 记录实验数据 并测得原始菌液中活菌数及芽孢数 以此计算出芽孢回 收率 菌体浓度及菌体回收率 2 4 5 硅藻土对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 取出四支试管 每支试管加入 20ml 菌液 将四支试管标号 1 4 号 分别加入 0 4 0 8 1 2 1 6ml 硅藻土溶液 此时每支试管中的硅藻土浓度分别为 0 1 0 2 0 3 0 4 盖好试管塞后上下摇晃均匀 静止并开始计时 30 分钟后 按以上检测方法测得上清液活菌数及芽孢数 待 60 分钟后重复此 实验步骤 记录实验数据 并测得原始菌液中活菌数及芽孢数 以此计算出芽孢回 收率 菌体浓度及菌体回收率 2 4 6 沸石粉对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 取出四支试管 每支试管加入 20ml 菌液 将四支试管标号 1 4 号 分别加入 0 0 8 1 2 1 6ml 沸石粉溶液 此时每支试管中的沸石粉浓度分别为 0 0 2 0 3 0 4 盖好试管塞后上下摇晃均匀 静止并开始计时 30 分钟后 按以上检测方法测得上清液活菌数及芽孢数 待 60 分钟后重复此 实验步骤 记录实验数据 并测得原始菌液中活菌数及芽孢数 以此计算出芽孢回 收率 菌体浓度及菌体回收率 2 4 7 碳酸钙对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 取出四支试管 每支试管加入 20ml 菌液 将四支试管标号 1 4 号 分别加入 0 8 1 1 2 1 4ml 碳酸钙溶液 此时每支试管中的碳酸钙浓度分别为 0 4 0 5 0 6 0 7 盖好试管塞后上下摇晃均匀 静止并开始计时 9 30 分钟后 按以上检测方法测得上清液活菌数及芽孢数 待 60 分钟后重复此 实验步骤 记录实验数据 并测得原始菌液中活菌数及芽孢数 以此计算出芽孢回 收率 菌体浓度及菌体回收率 2 4 8 离心对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝实验 取出适量菌液于烧杯中 测得烧杯加菌液的总重量 同时准备另一烧杯加入适 量的水 使得加入水的烧杯总重量和加入菌液的烧杯总重量相同 放入离心机中离 心 采用 5000 转 分钟 离心 10 分钟 将上清液取出直接进行计数 无需稀释 测 得上清液活菌数及芽孢数 记录实验数据 并测得原始菌液中活菌数及芽孢数 以 此计算出芽孢回收率 菌体浓度及菌体回收率 同时测得吸光度与透光率 2 4 9 絮凝剂的优化实验 优化实验选取以上实验现象最明显 数据最优的一种絮凝剂 并选取其最适的 絮凝浓度 同时加入未加入絮凝剂的空白对照组进行对照 并与离心进行对比优化 判断可否替代离心沉降微生物 从而选出最佳絮凝剂及絮凝浓度 有机絮凝剂的优化 首先配制 1 的壳聚糖溶液 取出两支试管 每支试管加入 20ml 菌液 将两支试管标号为 1 2 号 分别加入 0 2ml 壳聚糖溶液 此时每支试 管中的壳聚糖浓度分别为 0 0 1 盖好试管塞后上下摇晃均匀 静止并开始计时 30 分钟后 按以上检测方法测得上清液活菌数及芽孢数 待 60 分钟后重复此 实验步骤 最后待 24 小时后再次重复此实验步骤 记录实验数据 并测得原始菌液 中活菌数及芽孢数 以此计算出芽孢回收率 菌体浓度及菌体回收率 并测得 24 小 时后上清液的吸光度与透光率 同时重复离心实验 将实验结果与离心做比较 无机絮凝剂的优化 首先配制 5 的硅藻土溶液 取出三支支试管 每支试管加 入 20ml 菌液 将三支试管标号为 1 2 3 号 分别加入 0 1 2 1 6ml 硅藻土溶液 此时每支试管中的硅藻土浓度分别为 0 0 3 0 4 盖好试管塞后上下摇晃均匀 静止并开始计时 30 分钟后 按以上检测方法测得上清液活菌数及芽孢数 待 60 分钟后重复此 实验步骤 最后待 24 小时后再次重复此实验步骤 记录实验数据 并测得原始菌液 中活菌数及芽孢数 以此计算出芽孢回收率 菌体浓度及菌体回收率 并测得 24 小 时后上清液的吸光度与透光率 同时重复离心实验 将实验结果与离心做比较 10 最后通过比较有机型絮凝剂和无机型絮凝剂絮凝结果 来选取微生物的最适絮 凝剂及最适浓度 第3章 结果与讨论 3 1有机絮凝剂对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果 3 1 1 壳聚糖 DAC 90 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 壳聚糖 DAC 90 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝的效果较好 加入壳聚糖摇匀后 可以明显的看到一个清晰的上清液和沉淀的分界液面向下缓慢下降 经过沉淀后的 上清液十分清澈 下层沉淀密实程度各不相同 以壳聚糖含量为 0 1 的试管沉淀最 多 最松散 沉淀高度并以此为界分别向两边下降 沉淀逐渐变得密实 但上清液 的清澈程度与之成反比 结果如图 3 1 3 2 所示 随着壳聚糖加入量的减少或增加 菌体回收率逐渐下降 通过比较 壳聚糖含量为 0 1 的的芽孢回收率也为最高值 是絮凝微生物的最适浓度 图 3 1 壳聚糖 DAC 90 的芽孢回收率 11 图 3 2 壳聚糖 DAC 90 的菌体回收率 3 1 2 壳聚糖 DAC 85 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 壳聚糖 DAC 85 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝的效果一般 加入壳聚糖摇匀后 可以看到上清液和沉淀的分界液面向下缓慢下降 经过沉淀后的上清液不算十分清 澈 下层沉淀密实程度各不相同 以加入壳聚糖含量为 0 1 的试管沉淀最多 最松 散 沉淀高度并以此为界分别向两边下降 沉淀逐渐变得密实 但上清液的清澈程 度与之成反比 结果如图 3 3 3 4 所示 壳聚糖含量为 0 1 对酪酸梭状芽孢杆菌 的絮凝效果最好 随着壳聚糖加入量的减少或增加 菌体回收率逐渐下降 通过比 较 壳聚糖含量为 0 1 的芽孢回收率也为最高值 是絮凝微生物的最适浓度 图 3 3 壳聚糖 DAC 85 的芽孢回收率 12 图 3 4 壳聚糖 DAC 85 的菌体回收率 3 1 3 水溶性壳聚糖对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 水溶性壳聚糖对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝的效果也一般 加入壳聚糖摇匀后 可以看到上清液和沉淀的分界液面向下缓慢下降 经过沉淀后的上清液不算十分清 澈 下层沉淀密实程度各不相同 以加入壳聚糖含量为 0 2 的试管沉淀最多 最松 散 沉淀高度并以此为界分别向两边下降 沉淀逐渐变得密实 但上清液的清澈程 度与之成反比 即壳聚糖含量为 0 2 的试管上清液最为清澈 结果如图 3 5 3 6 所 示 随着壳聚糖加入量的减少或增加 菌体回收率逐渐下降 而就芽孢回收率来说 随着壳聚糖加入量的增加 芽孢回收率逐渐升高 加入壳聚糖含量为 0 2 的芽孢回 收率并非为最大值 但加入的壳聚糖较少 是絮凝微生物的最适浓度 图 3 5 水溶性壳聚糖的芽孢回收率 13 图 3 6 水溶性壳聚糖的菌体回收率 3 1 4 生物絮凝剂对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 生物絮凝剂是一种天然生物高分子絮凝剂 由微生物产生并分泌到细胞外 是 具有絮凝活性的微生物代谢产物即微生物胞外多糖 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝的 效果不佳 加入生物絮凝剂摇匀后 溶液无较为明显的液固液面 经过沉淀后的上 清液不算十分清澈 比较浑浊 下层沉淀密实程度基本相同且沉淀体积也一样 从 清澈度无法看出哪一试管上清液比较清澈 效果好 结果如图3 7 3 8所示 通过 比较 芽孢回收率随着生物絮凝剂含量的升高而升高 即生物絮凝剂含量为25 的芽 孢回收率较高 从菌体回收率来看生物絮凝剂含量为15 的效果较好 是絮凝微生物 的最适浓度 图 3 7 生物絮凝剂的芽孢回收率 14 图 3 8 生物絮凝剂的菌体回收率 3 1 5 离心絮凝酪酸梭状芽孢杆菌 采用 5000 转 分钟 离心 10 分钟 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果最好 上清 液清澈透明似水 颜色为淡黄色 且沉淀密实 结果如表 3 1 表 3 1 离心对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果 转数芽孢回收率 菌体浓度 1 10 8 菌体回收率 透光率吸光度 5000 转 10min 99 200 00499 7896 80 016 3 1 6 絮凝剂的优化 壳聚糖 DAC 90 对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 根据各数据结果及实验现象比较可见 壳聚糖 DAC 90 含量为 0 1 对酪酸 梭状芽孢杆菌的絮凝效果最好 实验现象与之前的现象相同 均为混匀后即刻出现 沉淀 结果如图 3 9 可以清楚看到芽孢回收率随时间变化较小 通过观察图 3 10 可以看到初期壳聚糖含量为 0 1 的菌体回收率比未加入壳聚糖的菌体回收率 高 但 24 小时后菌体回收率基本持平 如表 3 2 3 3 根据数据与实验现象及其 T 值与 A 值 壳聚糖 DAC 90 虽不及离心的效果好 但实验现象较明显 结果最 为接近离心效果 15 表 3 2 壳聚糖 DAC 90 对酪酸梭状芽孢杆菌絮凝 24 小时后的透光率与吸光度 加入壳聚糖含量透光率吸光度 045 10 347 0 1 65 40 185 表 3 3 离心对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果 转数芽孢回收率 菌体浓度 1 10 8 菌体回收率 透光率吸光度 5000 转 10min 99 290 00599 8596 40 016 图 3 9 壳聚糖 DAC 90 的芽孢回收率 16 图 3 10 壳聚糖 DAC 90 的菌体回收率 3 2 无机絮凝剂对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果 3 2 1 硅藻土对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 硅藻土对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝的效果一般 加入硅藻土摇匀后 溶液颜色 加深 应该为加入了硅藻土所致 而溶液并未出现上清液和沉淀的分界液面 而是 试管上方颜色缓慢变浅 经过沉淀后的上清液不是很清澈 有些浑浊 下层沉淀密 实程度相同 较为厚实 结果如图 3 11 3 12 所示 硅藻土含量为 0 3 的对酪酸 梭状芽孢杆菌的絮凝效果最好 无论芽孢回收率还是菌体回收率都为最高值 是絮 凝微生物的最适浓度 图 3 11 硅藻土的芽孢回收率 17 图 3 12 硅藻土的菌体回收率 3 2 2 沸石粉对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 沸石粉对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝的效果一般 加入沸石粉摇匀后 溶液颜色 加深 应该为加入了沸石粉所致 而溶液并未出现上清液和沉淀的分界液面 而是 试管上方颜色缓慢变浅 经过沉淀后的上清液不是很清澈 有些浑浊 下层沉淀密 实程度相同 较为厚实 结果如图 3 13 3 14 所示 沸石粉含量为 0 3 的絮凝效 果最好 通过观察 无论芽孢回收率还是菌体回收率都为最高值 是絮凝微生物的 最适浓度 图 3 13 沸石粉的芽孢回收率 18 图 3 14 沸石粉的菌体回收率 3 2 3 碳酸钙对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 碳酸钙对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝的效果不好 加入碳酸钙摇匀后 溶液浑浊 呈乳白色 无较为明显的液固液面 经过沉淀后的上清液不算十分清澈 比较浑浊 下层沉淀密实程度基本相同且沉淀体积相差较少 加入碳酸钙的试管沉淀很密实 且沉淀的速度要比未加入碳酸钙的试管沉淀的快 结果如图 3 15 3 16 所示 芽孢 回收率相差无几 但通过观察 可以看到就菌体回收率来说 碳酸钙含量为 0 6 对 酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果最好 是絮凝微生物的最适浓度 图 3 15 碳酸钙的芽孢回收率 19 图 3 16 碳酸钙的菌体回收率 3 2 4 絮凝剂的优化 硅藻土对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝 根据各数据结果及实验现象比较可见 硅藻土对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果 最好 实验现象与之前的现象相同 均为混匀后试管上方溶液逐渐变浅 没有溶液 与沉淀的分界面 结果如表 3 4 3 5 及图 3 17 3 18 根据数据与实验现象及其 T 值与 A 值 硅藻土不及离心的效果好 实验现象与结果均不如意 无法接近离心 效果 不可作为替换离心的方法 表 3 4 硅藻土对酪酸梭状芽孢杆菌絮凝 24 小时后的透光率与吸光度 加入硅藻土含量透光率吸光度 035 1 0 456 0 3 34 90 457 0 4 31 50 502 表 3 5 离心对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果 转数芽孢回收率 菌体浓度 1 10 8 菌体回收率 透光率吸光度 5000 转 10min 99 310 002399 9196 30 017 20 图 3 17 硅藻土的芽孢回收率 图 3 18 硅藻土的菌体回收率 第 4 章 结论 本研究通过对酪酸梭状芽孢杆菌絮凝的研究 得出以下结论 1 从无机絮凝剂和有机絮凝剂的优化效果来看 有机壳聚糖 DAC 90 对酪 酸梭状芽孢杆菌的絮凝沉淀效果最好 可以取代离心絮凝微生物 节约能源 如电 能的最佳物质 其絮凝酪酸梭状芽孢杆菌的最适浓度为 0 1 2 所有壳聚糖在其最佳絮凝微生物的浓度下 都会出现沉淀反而最多最松散现 象 随着浓度偏离最佳絮凝微生物的浓度 其沉淀相对较少也较为密实 21 3 无机絮凝剂与生物制剂对酪酸梭状芽孢杆菌的絮凝效果没有有机絮凝剂壳聚 糖的絮凝效果好 加入絮凝剂后其菌液均无明显的固液分界面 且加入絮凝剂的菌 液颜色加深 不好辨别清澈度的差异 4 由于壳聚糖具有许多优良的特性 而广泛用于各行各业 特别对污水处理中 微生物的沉降效果显著 如今壳聚糖在世界各地供不应求 壳聚糖及其产品的市场 潜力十分可观 而我国海域辽阔 湖泊众多 蟹 虾资源非常丰富 所以壳聚糖是取 之不尽的 充分利用这一优势将为我们国家经济发展提供又一个产业支柱 参考文献 1 Fujita I Maeda A Takashik Studies on the anti diarrneal activity of Clostridium butyricum Miyairi 588 J Jpn Pharmacol Ther 1986 14 6073 6080 2