国自然 面上项目标书范例

精品文档 1欢迎下载1欢迎下载 申请代码 H1606 受理部门 收件日期 受理编号 解除保护 国家自然科学基金国家自然科学基金 申申 请请 书书 2 2 0 0 1 1 0 0版版 资助类别 面上项目 亚类说明 附注说明 项目名称 Pyk2 促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究 结合 并磷酸化 E cadherin 申 请 人 电话 依托单位 通讯地址 邮政编码 266021 单位电话 电子邮箱 申报日期 2010 年 2 月 26 日 国家自然科学基金委员会 精品文档 2欢迎下载2欢迎下载 基本信息基本信息 yoKWT OQyoKWT OQ 姓名性别男 出生 年月 1973 年 4 月民族汉族 学位博士职称副主任医师每年工作时间 月 8 电话电子邮箱 传真 国别或地区 中国 个人通讯地址 工作单位 申申 请请 人人 信信 息息 主要研究领域肿瘤分子生物学 名称 联系人电子邮箱 依托单位信息依托单位信息 电话网站地址 单 位 名 称 复旦大学 合作研究单位信息合作研究单位信息 在此录入修改 项目名称 Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究 结合并磷酸化E cadherin 资助类别面上项目 亚类说明 附注说明 申请代码H1606 肿瘤复发与转移H1617 消化系统肿瘤 基地类别 研究年限2011 年 1 月 2013 年 12 月研究属性基础研究 项项 目目 基基 本本 信信 息息 申请经费35 0000 万元 摘摘 要要 限限 400400 字字 E cadherin 的丧失与肝癌转移密切相关 其丧失的主要原因是由于其酪氨酸 残基被磷酸化后蛋白被降解 我们通过酵母双杂交发现一个新的能与 E cadherin 相互作用 的非受体型酪氨酸激酶 Pyk2 Pyk2 活性增强可促进肝癌细胞迁移 本课题假设 Pyk2 结合 并磷酸化 E cadherin 导致 E cadherin 蛋白降解 细胞迁移性增加 本课题设计首先通过 GST pulldown 免疫共沉淀证明二者相互作用可靠 其次通过磷酸化实验确证 Pyk2 可以磷 酸化 E cadherin 然后应用细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验确定 Pyk2 通过磷酸化 E cadherin 而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移 最后分析在人肝癌标本中二者表达的相关性以 及与转移的关系 本课题新发现 Pyk2 可以直接磷酸化 E cadherin 促进肝癌细胞迁移和肿 瘤转移 具有国际先进性 这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解 对于药物研发提 供新的思路 精品文档 3欢迎下载3欢迎下载 关关 键键 词词 用分号分开 最多 5 个 肝癌 E cadherin Pyk2 肿瘤转移 精品文档 4欢迎下载4欢迎下载 经费申请表经费申请表 金额单位 万元 科目申请经费备注 计算依据与说明 一一 研究经费研究经费28 7500 1 科研业务费7 6000 1 测试 计算 分析费2 1000DNA 测序 生物信息分析 统计分析 2 能源 动力费 3 会议费 差旅费1 0000参加学术会议 3 4 人次 4 出版物 文献 信息传播费3 0000文献检索 发表论文 专利申请 5 其他1 5000成果鉴定 2 实验材料费21 1500 1 原材料 试剂 药品购置费17 1500 各种试剂盒 脂质体 抗体 细胞培养 实验耗 材 2 其他4 0000动物饲养 临床调研 3 仪器设备费0 0000 1 购置 2 试制 4 实验室改装费 5 协作费 二二 国际合作与交流费国际合作与交流费1 5000 1 项目组成员出国合作交流 2 境外专家来华合作交流1 5000邀请美国康奈尔大学关军林教授合作交流 三三 劳务费劳务费3 0000研究生加班补贴 四四 管理费管理费1 75005 管理费 合合 计计35 0000 国家其他计划资助经费 其他经费资助 含部门匹配 与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计其他经费来源合计0 0000 精品文档 5欢迎下载5欢迎下载 报告正文报告正文 查看报告正文撰写提纲 一 立项依据与研究内容一 立项依据与研究内容 一 项目的立项依据 一 项目的立项依据 原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一 我国的肝癌发病数占全球所有肝癌病例的 一半左右 因此我国对于肝癌的研究显得非常迫切 1 肝癌非常容易转移 其复发转 移是治疗失败的主要原因 了解肝癌侵袭转移的相关机制 对于设计合理的治疗药物 进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义 2 E cadherin在肝癌细胞的侵袭 转移中起到了不可忽视的作用 E cadherin属于 钙粘附蛋白家族 Cadherin 家族 在调节细胞与细胞之间 细胞与基质之间的粘附反 应 介导细胞间的接触抑制和凋亡等方面发挥重要作用 E cadherin与 catenin p120等形成复合体发挥上述功能 3 E cadherin与多种肿瘤的浸润转移密切相关 4 5 有人认为提高E cadherin的 表达可以成为肿瘤治疗的一个方向 6 与其他肿瘤类似 研究表明E cadherin在肝细 胞癌的阳性率显著低于癌旁组织及正常肝组织 表达越低则肿瘤病理分级越差 也越 容易出现转移 7 9 有人报道缺乏E cadherin表达的人肝癌细胞株非常容易发生转移 但是转染E cadherin后这种特性发生逆转 说明E cadherin在肝癌细胞转移过程中发 挥着重要的作用 10 E cadherin丧失或低表达的机制至今仍然不是完全清楚 目前认为可能是由于基 因突变导致功能丧失 启动子甲基化后转录沉默 11 以及E cadherin蛋白被磷酸化后水 解等 但是在亚洲人群中基因突变和启动子甲基化都不常见 12 13 因此最大的可能 性是E cadherin蛋白被磷酸化后水解 有文献证明 酪氨酸残基磷酸化的E cadherin 能够与Hakai 一种E3泛素连接酶 结合 使其泛素化而降解 14 那么有多少酪氨酸 激酶参与这个机制呢 有报道EGFR IGF 1R能够磷酸化E cadherin 对于E cadherin 磷酸化的调节机制目前仍然不是非常明确 为了解E cadherin在肝癌细胞的分子信号通路 我们以E cadherin 胞内段 为 诱饵应用酵母双杂交 CytoTRAP系统 在肝脏的cDNA文库中筛选到一个新的能与E cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶 Pyk2 那么 Pyk2是否能磷酸化E cadherin 并调节细胞迁移呢 Pyk2 proline rich tyrosine kinase 2 是一种富含脯氨酸的非受体型酪氨酸蛋 白激酶 与FAK同源度较高 属于FAK家族 Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀 在 调节细胞存活 增殖和迁移 16 方面受到越来越多的关注 Pyk2信号通路的活化能够增 强细胞运动和迁移 研究发现Pyk2在多种肿瘤的侵袭和转移中起作用 17 18 其中Sun 等研究表明 Pyk2在59 的肝癌组织中表达上调 Pyk2高表达与肝癌组织体积 精品文档 6欢迎下载6欢迎下载 Edmonson分级呈正相关 Pyk2表达越高病人预后越差 动物实验显示在侵袭边缘的肝 癌细胞和转移到肺结节中的肝癌细胞均发现Pyk2高表达 肝癌细胞株转染Pyk2后 其 迁移功能增强 而用裸鼠做实验发现抑制Pyk2的活性后肝癌肿瘤的大小和肺转移率都 较对照明显减少 19 20 Pyk2 调节肿瘤转移的具体机制是什么呢 有研究表明 在肝癌细胞中 Pyk2 提高 c Src 的磷酸化水平和活性 与 c Src 形成复合体激活 ERK 通路 从而增强肝癌细胞的 侵袭性 19 20 也有报道 Pyk2 与 PECAM 1 血小板 内皮细胞粘附分子 与 E cadherin 一样都属于钙粘附蛋白家族 结合并且都影响肿瘤细胞的侵袭性 21 还有报道 RhoC 通过激活 Pyk2 促进前列腺癌转移 18 以及与 SOCS3 Cyr61 有关等 22 23 总而言之 目前 Pyk2 调节肿瘤细胞转移的具体机制仍不十分清楚 Pyk2与E cadherin能否结合并调节肝癌细胞的侵袭转移呢 这是我们想要研究的 问题 我们继续应用酵母双杂交反复验证 GST Pulldown实验 免疫共沉淀证明二者 相互作用是可靠的 具体结果见研究基础 那么 现在的问题是二者在体内状态下是 否结合 结合后的调节机制是什么 二者的结合位点在什么地方 结合后如何调节细 胞迁移以及影响肿瘤转移 考虑到Pyk2是一个激酶蛋白 我们的前期工作发现E cadherin与Pyk2的激酶部分 结合 因此有两种可能性 一种是Pyk2磷酸化E cadherin 另外一种就是E cadherin 抑制Pyk2的磷酸激酶活性 我们认为第一种可能性较大 有文献报道 Pyk2能磷酸化 VE cadherin E cadherin同源家族成员 并且抑制其与Catenin P120等形成复合体 24 25 E cadherin与VE cadherin同源性很高 理化性质相似 Pyk2能够磷酸化VE cadherin应该也有可能磷酸化E cadherin 因此我们有理由推测 由于肿瘤始动因素 的作用 Pyk2表达增多 活性增强 从而磷酸化E cadherin 导致E cadherin降解 最终使细胞迁移性增强 但是也不能排除第二种可能性 E cadherin抑制Pyk2的磷酸 激酶活性 从而导致肿瘤细胞侵袭性下降 申请人以前的工作就发现钙粘附蛋白家族 的另外一个成员 Protocadherins能够抑制Pyk2的活性 26 申请人做这方面工作时 曾取E cadherin做对比参照 结果发现抑制Pyk2激酶活性不是很明显 本数据未发表 因此不支持第二种可能性 二者具体如何调节还需要进一步实验来证实 本课题的设计主要是为了解答上述问题 首先在前期工作基础上继续明确 Pyk2 与 E cadherin 能相互作用以及调节机制 其次应用细胞迁移实验确定二者的调节对肿瘤 细胞迁移 侵袭性的影响 然后应用裸鼠成瘤转移实验明确二者的调节在对肝癌远处 转移的影响 最后分析在肝癌病人组织标本中二者表达的相关性以及与转移的相关性 本课题在国际上最新发现 Pyk2 与 E cadherin 直接相互作用 并且确定其结合机制 明确这种调节与肝癌细胞迁移力和肿瘤转移的关系 这对于肝癌侵袭转移的复杂机制 有新的理解 许多新型抗癌药物如赫赛汀 格列卫 吉非替尼 厄洛替尼都是以酪氨 精品文档 7欢迎下载7欢迎下载 酸激酶为治疗靶点 取得非常好的疗效 本研究对于确定 E cadherin 和酪氨酸激酶 Pyk2 做为分子治疗靶点 设计合理的治疗药物可以提供更有利的素材 参考文献 1 He J Gu D Wu X et al Major causes of death among men and women in China N Engl J Med 2005 353 1124 34 2 吴孟超 廖美琳 陆嘉德 常见恶性肿瘤治疗进展 上海 科技教育出版社 2007 3 Bryant DM Stow JL The ins and outs of E cadherin trafficking Trends Cell Biol 2004 Aug 14 8 427 34 4 Wells A Yates C Shepard CR E cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas Clin Exp Metastasis 2008 25 6 621 8 Epub 2008 Jul 4 5 Salon C Lantuejoul S Eymin B et al The E cadherin beta catenin complex and its implication in lung cancer progression and prognosis Future Oncol 2005 Oct 1 5 649 60 6 Howard EW Camm KD Wong YC et al E cadherin upregulation as a therapeutic goal in cancer treatment Mini Rev Med Chem 2008 May 8 5 496 518 7 Guo C Liu QG Yang W et al Relation among p130Cas E cadherin and beta catenin expression clinicopathologic significance and prognosis in human hepatocellular carcinoma Hepatobiliary Pancreat Dis Int 2008 Oct 7 5 490 6 8 Zhai B Yan HX Liu SQ et al Reduced expression of E cadherin catenin complex in hepatocellular carcinomas World J Gastroenterol 2008 Oct 7 14 37 5665 73 9 Fransvea E Angelotti U Antonaci S et al Blocking transforming growth factor beta up regulates E cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells Hepatology 2008 May 47 5 1557 66 10 Osada T Sakamoto M Ino Y et al E cadherin is involved in the intrahepatic metastasis of hepatocellular carcinoma Hepatology 1996 Dec 24 6 1460 7 11 Auerkari EI Methylation of tumor suppressor genes p16 INK4a p27 Kip1 and E cadherin in carcinogenesis Oral Oncol 2006 Jan 42 1 5 13 12 Wei Y Van Nhieu JT Prigent S et al Altered expression of E cadherin in hepatocellular carcinoma Correlations with genetic alterations catenin expression and clinical features Hepatology 2002 Sep 36 3 692 701 13 Yu J Ni M Xu J et al Methylation profiling of twenty promoter CpG islands of genes which may contribute to hepatocellular carcinogenesis BMC Cancer 2002 2 29 14 Fujita Y Krause G Scheffner M Hakai et al Hakai a c Cbl like protein ubiquitinates and induces endocytosis of the E cadherin complex Nat Cell Biol 2002 Mar 4 3 222 31 15 McLachlan R W Yap A S Not so simple the complexity of phosphotyrosine signaling at cadherin adhesive contacts J Mol Med 2007 85 545 554 16 Avraham H Park SY Schinkmann K et al RAFTK Pyk2 mediated cellular signalling Cell Signal 2000 Mar 12 3 123 33 17 Behmoaram E Bijian K Jie S et al Focal adhesion kinase related proline rich tyrosine kinase 2 and focal adhesion kinase are co overexpressed in early stage and invasive ErbB 2 positive breast cancer and cooperate for breast cancer cell 精品文档 8欢迎下载8欢迎下载 tumorigenesis and invasiveness Am J Pathol 2008 Nov 173 5 1540 50 18 Iiizumi M Bandyopadhyay S Pai SK et al RhoC promotes metastasis via activation of the Pyk2 pathway in prostate cancer Cancer Res 2008 Sep 15 68 18 7613 20 19 Sun CK Man K Ng KT et al Proline rich tyrosine kinase 2 Pyk2 promotes proliferation and invasiveness of hepatocellular carcinoma cells through c Src ERK activation Carcinogenesis 2008 Nov 29 11 2096 105 20 Sun CK Ng KT Sun BS et al The significance of proline rich tyrosine kinase2 Pyk2 on hepatocellular carcinoma progression and recurrence Br J Cancer 2007 Jul 2 97 1 50 7 21 Zhang X Xu LH Yu Q Cell aggregation induces phosphorylation of PECAM 1 and Pyk2 and promotes tumor cell anchorage independent growth Mol Cancer 2010 Jan 14 9 7 22 Zhang S Guo D Jiang L et al SOCS3 inhibiting migration of A549 cells correlates with PYK2 signaling in vitro BMC Cancer 2008 8 150 23 Vitale G Gentilini D Abbruzzese A et al Pyk2 and Cyr61 at the cross road of cAMP dependent signalling in invasiveness and neuroendocrine differentiation of prostate cancer Cancer Biol Ther 2009 8 24 Turowski P Martinelli R Crawford R et al Phosphorylation of vascular endothelial cadherin controls lymphocyte emigration J Cell Sci 2008 Jan 1 121 Pt 1 29 37 25 Potter MD Barbero S Cheresh DA Tyrosine phosphorylation of VE cadherin prevents binding of p120 and beta catenin and maintains the cellular mesenchymal state J Biol Chem 2005 Sep 9 280 36 31906 12 26 Jian Chen Lu Y Meng S et al alpha and gamma Protocadherins Negatively Regulate PYK2 J Biol Chem 2009 Jan 30 284 5 2880 90 精品文档 9欢迎下载9欢迎下载 二 项目的研究内容 研究目标 二 项目的研究内容 研究目标 以及拟解决的关键科学问题 以及拟解决的关键科学问题 主要研究内容主要研究内容 1 1 确定 确定 E cadherinE cadherin 与与 Pyk2Pyk2 体外 体内相互作用 作用位点以及调节关系 体外 体内相互作用 作用位点以及调节关系 A 取 E cadherin 与 Pyk2 不同结构域和不同突变体 应用酵母双杂交 GST Pull Down 以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域 以及作用位点 B 选取二者表达量都适中的肝癌组织 行内源性免疫共沉淀 证明在体内二者也 相互作用 C 应用免疫荧光技术和蔗糖密度梯度超速离心方法分析细胞组分的方法确定 E cadherin 与 Pyk2 在细胞中共定位 D 应用磷酸化实验 确定 E cadherin 是否是 Pyk2 的底物 应用定点突变的方法 确定酪氨酸的磷酸化位点 同时再次确证 E cadherin 能否影响 Pyk2 激酶活性 2 2 从细胞水平确定 从细胞水平确定 Pyk2Pyk2 对对 E cadherinE cadherin 的调节影响细胞迁移 的调节影响细胞迁移 A 筛选 Pyk2 稳定表达细胞株 然后应用 Transwell 细胞迁移实验观察过表达 Pyk2 的细胞其迁移性 侵袭性的变化 检测过表达 Pyk2 时 E cadherin 的磷酸化状态 和蛋白水平的变化 确定 Pyk2 对 E cadherin 磷酸化状态的调节影响细胞迁移 B 取高转移肝癌细胞株 MHCC97 H HCCLM3 购自上海中山医院肝癌研究所 应 用 RNAi 技术沉默 Pyk2 的表达 观察细胞迁移性 侵袭性的变化 检测相应状态下 E cadherin 的磷酸化状态和表达水平的变化 从相反方向确定 Pyk2 的表达抑制后对 E cadherin 磷酸化状态的调节 以及这种调节对细胞迁移的影响 3 3 从动物模型水平确定 从动物模型水平确定 Pyk2Pyk2 对对 E cadherinE cadherin 的调节影响肿瘤转移 的调节影响肿瘤转移 应用 Pyk2 稳定表达细胞株接种裸鼠 观察裸鼠肿瘤肺转移肝转移情况 分析 Pyk2 的过表达对 E cadherin 磷酸化状态的调节关系 以及与肿瘤转移的相关性 4 4 从肝癌病人标本中寻找 从肝癌病人标本中寻找 Pyk2Pyk2 与与 E cadherinE cadherin 磷酸化状态的相关性 以及与肿瘤磷酸化状态的相关性 以及与肿瘤 转移的的相关性 转移的的相关性 收集肝癌标本 应用免疫组化和 Western 等方法确定 Pyk2 的表达水平的变化与 E cadherin 磷酸化状态和蛋白水平的相关性 以及二者与肿瘤转移的相关性 研究目标研究目标 1 确定 Pyk2 结合 E cadherin 相互作用的结构域及磷酸化位点 并阐明其调节机 制 2 确定 Pyk2 与 E cadherin 的调节可影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移 拟解决的关键科学问题拟解决的关键科学问题 E cadherin 酪氨酸残基的磷酸化导致其被降解 增加细胞侵袭性 本课题能够确 精品文档 10欢迎下载10欢迎下载 定酪氨酸激酶 Pyk2 能否磷酸化 E cadherin Pyk2 与 E cadherin 的调节是否是调节肿 瘤细胞转移的新的分子机制 三 拟采取的研究方案及可行性分析 三 拟采取的研究方案及可行性分析 研究方法研究方法 GST pull down 荧光共定位 内源 外源免疫共沉淀 蔗糖密度梯度超速离心 磷酸化实验 定点突变 稳定表达细胞株的筛选 RNAi 抑制 Pyk2 表达 细胞迁移 侵袭实验 裸鼠成瘤肿瘤转移实验 免疫组化 定量 PCR Western 检测等 关键技术说明 关键技术说明 1 磷酸化实验 首先应用酪氨酸激酶的通用底物 E4Y1 作为阳性参照 以纯化的 GST E cadherin 蛋白为底物 以 GST 蛋白作为阴性对照 观察 Pyk2 是否可以磷酸化 E cadherin 如果能磷酸化 E cadherin 则应用生物信息分析 定点突变 寻找磷酸化位点 如果 不能磷酸化 E cadherin 则以通用底物 E4Y1 作为底物 加入不同量的 E cadherin 观察是否可以影响 Pyk2 的激酶活性 2 细胞迁移实验 首先分别用空载体 PCDNA3 1 PCDNA3 1 Pyk2 Myc PCDNA3 1 PRNK Myc 转染肝 癌细胞株 PRNK 为 Pyk2 的 C 段 为 Pyk2 的失活突变体 用 G418 筛选出稳定表达 细胞株 并检测稳定表达细胞株 Pyk2 蛋白表达量的不同 然后应用稳定表达细胞株做 Transwell 细胞迁移和侵袭实验 比较细胞迁移率的 变化 检测细胞迁移率的变化与 Pyk2 蛋白表达量的关系 同时取相应细胞做定量 PCR Western 蛋白定量 磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较 E cadherin 在转录水平 蛋白水平 磷酸化水平的变化以及这些变化与肿瘤迁移的关系 与 Pyk2 蛋白表达量 的关系 3 裸鼠成瘤肿瘤转移实验 取上述三组稳定表达细胞株分别接种裸鼠 待肿瘤直径约 1 1 5cm 时取出肿瘤重 新接种于另外一批裸鼠的肝左叶 接种 5 星期左右处死裸鼠 收集肝脏和肺脏 观 察肝内转移情况和肺转移情况 检测三组肿瘤 Pyk2 蛋白表达量的不同以及与肿瘤转 移的关系 同时取相应肿瘤做定量 PCR Western 蛋白定量 磷酸化抗体检测磷酸化 状态来比较 E cadherin 在转录水平 蛋白水平 磷酸化水平的变化 确定这些变化 与肿瘤转移的关系 与 Pyk2 蛋白表达量的关系 4 蔗糖密度梯度超速离心定位和内源免疫共沉淀 取肝癌肿瘤的癌旁组织 裂解离心 取裂解液上清 蔗糖密度梯度超速离心 取 离心后的不同组分样品做 Western 分别用 E cadherin 抗体和 Pyk2 抗体作为一抗检 精品文档 11欢迎下载11欢迎下载 测 如果二者表达最多的峰值是在同一个组分中 则提示我们二者在细胞内是共定 位的 取上述二者的表达较多的组分 用 Pyk2 单抗免疫沉淀 Pyk2 免疫球蛋白作对照 然后用 E cadherin 单抗杂交检测 E cadherin 是否能与 Pyk2 共沉淀下来 相反方向 则是 用 E cadherin 单抗免疫沉淀 E cadherin 免疫球蛋白作对照 然后用 Pyk2 单抗杂交检测 Pyk2 是否能与 E cadherin 共沉淀下来 技术路线技术路线 见下图 1 左侧部分 取 E cadherin 与 Pyk2 不同结构域和不同突变体 应用酵母双杂交 GST Pull Down 以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域 以及作用位点 荧光共定位 免疫组化 蔗糖密度梯度超速离心等方法验证二者在细胞以及肿瘤组 织中共定位 磷酸化实验确定 E cadherin 是 Pyk2 的磷酸化底物 以及磷酸化位点 这部分内容从生化的角度确定 Pyk2 磷酸化 E cadherin 的分子机制 2 中间部分 通过细胞迁移实验 裸鼠成瘤转移实验从细胞水平 动物模型确定 Pyk2 通过磷酸化 E cadherin 影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制 3 右侧部分 收集肝癌病人标本和临床资料 通过免疫组化 Western 等方法检测 E cadherin Pyk2 蛋白水平 磷酸化状态 分析二者表达量的相关性 以及与肝癌转 移的相关性 定点突变 GST pull down 免疫共沉淀等方法验证确定相 互作用的结构域以及位点 荧光共定位 免疫组化 蔗糖 密度梯度超速离心等方法验证 在细胞以及肿瘤组织中共定位 收集肝癌病人标 本和临床资料 免疫组化 Western 等方法检测E cadherin蛋白水平 磷酸化状态和Pyk2表 达量的相关性 以及 与肝癌转移的相关性 磷酸化实验确定 E cadherin 是否是 Pyk2 的磷酸化底物 以及磷酸化位点 细胞迁移实验 测 Pyk2 蛋白过表 达和 RNAi 抑制时与 E cadherin 磷酸化水平 细胞迁移的关系 筛选稳定表达 Pyk2 肝癌细胞株 检测 Pyk2 蛋白表达量与 E cadherin 磷酸化水平的关系 裸鼠成瘤转移实验 Pyk2 蛋白表 达量 E cadherin 磷酸化水平与 肿瘤转移的关系 汇总分析数据 揭示 Pyk2 磷酸化 E cadherin 机制 揭示 Pyk2 通过磷酸化 E cadherin 影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制 精品文档 12欢迎下载12欢迎下载 4 最下面部分为汇总数据 总结分析 4 4 可行性分析可行性分析 1 前期实验已经从酵母双杂交 GST Pull Down 免疫共沉淀等证实了 E cadherin 与 Pyk2 相互作用 见研究基础部分 而且二者功能上密切相关 E cadherin 作为一种细胞黏附分子在细胞黏附 细胞迁移和接触抑制方面具有作用 而 Pyk2 能通 过各种信号途径参与调节细胞黏附 扩散和迁移等过程 因此 二者在功能上是有互 相作用基础的 考虑到Pyk2是一个激酶蛋白 且前期实验结果提示Pyk2激酶区域结合E cadherin 因此有两种可能 一种是Pyk2磷酸化E cadherin 另外一种是E cadherin 抑制Pyk2激酶活性 我们认为第一种可能性较大 根据文献报道 Pyk2能磷酸化E cadherin的同源蛋白VE cadherin并且抑制其与Catenin P120等形成复合体 从而影 响细胞迁移 E cadherin与VE cadherin同源性很高 理化性质相似 Pyk2能够磷酸化 VE cadherin应该就有可能磷酸化E cadherin 因此我们有理由推测 由于肿瘤始动因 素的作用 Pyk2表达增多 活性增强 从而磷酸化E cadherin 导致E cadherin降解 最终使细胞迁移性增强 我们上述实验设计基本基于这个逻辑 磷酸化实验证实Pyk2 磷酸化E cadherin 导致E cadherin蛋白减少 细胞迁移实验和动物实验设计逻辑是 通过Pyk2过表达 检测E cadherin磷酸化增强 蛋白量减少 导致细胞迁移增强或者 肿瘤转移增加 RNAi抑制Pyk2的表达 则出现相反的结果 E cadherin磷酸化减弱 蛋白量增加 导致细胞侵袭性减弱和肿瘤肺转移减少 事实是否如此 需要实验来证 明 申请人以前的工作曾发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员 Protocadherins 能 够抑制 Pyk2 的活性 因此从逻辑上讲也不能完全排除第二种可能性 即 E cadherin 抑制 Pyk2 的磷酸激酶活性 如果是这样的话 则可能的假设是 在正常细胞中 E cadherin 抑制 Pyk2 的活性 在肿瘤条件下 由于其他原因 E cadherin 减少或消失 而不能抑制 Pyk2 活性 导致 Pyk2 活性增强 因而肿瘤细胞迁移性增强 如果基于这 个逻辑的话 实验设计就要改变为 磷酸化实验时应用酪氨酸激酶的通用底物 E4Y1 作 为底物 观察 E cadherin 对 Pyk2 激酶活性是否有抑制作用 然后筛选 E cadherin 过 表达 功能失活突变体和空载体的稳定表达肝癌细胞株 然后行细胞迁移实验和裸鼠 成瘤实验 观察 E cadherin 蛋白过表达或功能失活突变后与细胞迁移或者肿瘤转移的 关系 同时检测其与 Pyk2 蛋白表达量及磷酸化水平相关性 但是申请人在完成 Protocadherins 抑制 Pyk2 的活性的工作中曾取 E cadherin 做对比参照 结果发现 E cadherin 抑制 Pyk2 激酶活性不是很明显 因此这种可能性不大 从上面的分析来看 本课题在理论和逻辑上是可行的 2 本课题是本人前期工作的延续 本人对 E cadherin Pyk2 的研究非常熟悉 前 精品文档 13欢迎下载13欢迎下载 期工作构建的质粒表达载体等为本课题的下一步研究提供了很多有利的条件 本课题 组的成员对所需要的技术方法都很熟练 且都有相应的工作基础 可以在各个方面进 行协作 3 本课题所涉及的技术均为较成熟的技术 所需的设备和条件本校都具备 四 本课题的特色与创新之处 四 本课题的特色与创新之处 1 本课题通过酵母双杂交新发现一个与 E cadherin 相互作用的蛋白 非受体型酪 氨酸激酶 Pyk2 并证明两者的相互作用可靠 国内外研究至今未曾见过报道 具有国 际先进性和独创性 有报道二者的表达量与肿瘤转移的关系 但是二者直接相互作用 未见报道 2 本课题新发现 Pyk2 磷酸化 E cadherin 影响肝癌细胞转移的机制 对于 E cadherin 在肝癌转移过程中的分子机制有新的理解 因此具有独创性和先进性 五 年度研究计划及预期研究结果 五 年度研究计划及预期研究结果 1 1 年度研究计划年度研究计划 2011 01 2011 12 磷酸化实验确定二者的调节关系 肝癌组织内源免疫共沉淀确定相互 作用可靠 同时确定二者结合的结构域 磷酸化位点 蔗糖密度梯度 超速离心 荧光共定位等相关的实验进一步确证二者共定位 同时收 集病例标本 收集临床资料 纯化蛋白制备抗体 2012 01 2012 12 细胞迁移实验 裸鼠成瘤肿瘤转移实验检测 Pyk2 的表达与 E cadherin 的磷酸化状态 以及细胞迁移的关系 确定其调节机制 同 时完成 E cadherin Pyk2 的表达以及磷酸化状态与肝癌的分期 转移 预后 复发等临床指标的相关性分析 2013 01 2013 12 补充实验遗漏 整理实验资料 统计处理实验数据 撰写论文 2 2 预期研究结果预期研究结果 1 确定 Pyk2 能够磷酸化 E cadherin 以及二者相互作用的结构域以及磷酸化位点 2 确定 Pyk2 通过磷酸化 E cadherin 从而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移 3 确定在肝癌组织中 E cadherin 蛋白水平 磷酸化状态和 Pyk2 表达量的相关性 以及二者的表达与肝癌转移的相关性 4 在国外学术期刊上发表 SCI 论文 2 4 篇 其中影响因子大于 5 的有一篇以上 在国内核心期刊发表论文 2 4 篇 并在国内外学术会议交流 5 培养研究生 2 3 名 二 研究基础与工作条件二 研究基础与工作条件 一 一 研究基础研究基础 精品文档 14欢迎下载14欢迎下载 第一步 为了研究肝癌转移的机制 首先选取E cadherin 胞内段 以下实验同 为诱饵在肝脏的cDNA文库中做酵母双杂交 寻找与E cadherin相互作用的蛋白 我们 先选取的是LACZ系统蓝白斑筛选 但是因为背景高而放弃 后来选取CytoTRAP系统 背景明显减低 测序后有意义的基因有31个 其中有4个为Pyk2片段 通过克隆Pyk2基 因全 长验证 确定二者在酵母中的相互作用是强阳性的 图1 同时验证Pyk2的同源蛋白 FAK与E cadherin相互作用为可疑弱阳性 图1 酵母双杂交 CytoTRAP系统 验证Pyk2与E cadherin相互作用 pMyr Lamin为阴性对照 pMyr SB为阳性对照 E Cad为E Cadherin缩写 以下图示与此相同 Psos E Cad为诱饵蛋白 CytoTRAP系统酵母双杂交特点为两个蛋白如果不相互作用在25 时可以生 长 而在37 则不能生长 如阴性对照pMyr Lamin所示 两个蛋白如果相互作用则在两个温度下都 能生长 如阳性对照pMyr SB所示 pMyr Pyk2与阳性对照相似 第二步 原核表达E cadherin和His Pyk2进行GST Pulldown 为了验证二者是直 接结合 我们分别细菌中表达纯化GST E cadherin和His Pyk2 可惜His Pyk2全长非 常难纯化 得不到纯化的蛋白 我们表达纯化了His Pyk2的激酶部分 GST Pulldown 实验结果证实Pyk2的激酶部分能够与E cadherin直接结合 图2 泳道 1 2 3 精品文档 15欢迎下载15欢迎下载 图2 原核表达E cadherin和His Pyk2激酶部分进行GST Pulldown 分别原核表达GST GST E cadherin和His Pyk2激酶部分 取等量GST GST E cadherin 分别与相同量的His Pyk2激酶部分混合 加入谷胱甘肽琼脂糖珠孵育 重复洗三次 用his抗 体Western检测 结果显示His Pyk2激酶部分能够与GST E cadherin结合 泳道3 而不能与 GST结合 泳道2 泳道1上图是纯化的His Pyk2激酶部分的蛋白作为检测标准 第三步 原核表达E cadherin和细胞表达Myc Pyk2进行GST Pulldown 我们转染 Myc Pyk2于SYF细胞 SYF细胞株是酪氨酸激酶c Src Yes 和Fyn敲除的胚鼠中的成纤 维细胞建成的细胞系 用这个细胞株可以排除S