3蔗糖酶蛋白含量测定及活力测定

1 4 实实验验报报告告 课程名称 生物化学实验 甲 指导老师 杨劲树 成绩 同组学生姓名 一 实验目的和要求 三 实验材料和主要仪器 五 实验数据记录和处理 七 实验讨论和心得 二 实验内容和原理 四 实验方法和步骤 六 实验结果和分析 一 实验目的和要求一 实验目的和要求 1 学习 Folin 酚法测定蛋白质含量的原理和方法 2 掌握分光光度法制作标准曲线 准确测定未知样品的蛋白质含量 3 掌握分光光度计的使用方法 4 掌握酶活力测定的基本原理和方法 5 学习酶的比活力的计算 二 实验内容和原理二 实验内容和原理 Folin 酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的 Folin 酚试剂是由甲 乙两种试剂组成的 甲试剂由 碳酸钠 氢氧化钠 硫酸铜和酒石酸钾钠组成 在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用 生成 紫红色络合物 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸 硫酸 溴等组成 在碱性条件下 铜 蛋白质络合物以及蛋白质 中的酪氨酸残基 酚基 和色氨酸还原磷钼酸 磷钨酸试剂 乙试剂 产生深蓝色 钼蓝和钨蓝的混合物 其色泽深浅与蛋白质含量成正比 可用 500nm 波长比色测定 适于测定蛋白质含量 0 05 0 5g L 优点 简单 迅速 灵敏度高 反应较稳定 缺点 该反应受多种因素的干扰 蔗糖酶 D 呋喃型果糖苷 果糖水解酶 EC 3 2 1 26 是一种水解酶 它能催化非还原性双糖 蔗糖 的 1 2 糖苷键裂解 将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖 还原糖 因此 每水解 1mol 蔗糖 就能生成 2mol 还原糖 还原糖的测定有多种方法 例如 纳尔逊 索模吉 Nelson Smogyi 试剂比色法 斐林试剂法 等 本实验采用 3 5 二硝基水杨酸法测定还原糖的含量 由此可得出蔗糖酶水解速度 其原理是 3 5 二硝基水杨 酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物 在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比 因此可 利用分光光度计在 500nm 进行比色测定 求得样品中的含糖量 此法操作简便 迅速 杂质干扰较小 蔗糖酶活力单位蔗糖酶活力单位 u 蔗糖酶在室温 50 pH4 5 的条件下 每分钟水解产生 1 mol 葡萄糖所需的酶量 ml 专业 姓名 孙程珂 学号 3150100531 日期 地点 装 订 线 2 4 蔗糖酶比活力的计算 蔗糖酶比活力的计算 酶的比活力 为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数 一般用酶活力单位 mg 蛋白质表示 酶的比活力 在酶学研究中用来衡量酶的纯度 对于同一种酶来说 比活力越大 酶的纯度越高 利用比活力的大小可以用 来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力 是表示酶的纯度高低的一个重要指标 比活力 酶的总活力单位数除以总蛋白 mg 数 即每 mg 蛋白所含有的酶活力单位数 比活力 活力单位 mg 蛋白 实验名称 姓名 学号 三 实验材料和主要仪器三 实验材料和主要仪器 1 实验材料 蔗糖酶提取的各步分离纯化样品 可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释 2 实验试剂 1 Folin 酚测定法 标准蛋白质溶液 0 5g L 牛血清白蛋白 Folin 酚试剂 甲试剂 乙试剂 2 3 5 二硝基水杨酸比色法 1g L 葡萄糖标准溶液 葡萄糖相对分子量 198 17 5 蔗糖溶液 0 2mol L 乙酸缓冲液 pH4 5 3 5 二硝基水杨酸试剂 DNS 3 实验器材与仪器 1 恒温水浴 50 100 2 可见光分光光度计 1cm 玻璃比色皿 3 试管 试管架 4 移液管 5 微量移液器 200 l 1000 l 四 实验方法和步骤四 实验方法和步骤 1 制备 Folin 酚法蛋白质标准曲线 以光吸收值 A500 为纵坐标 标准蛋白质含量 mg 为横坐标 绘制蛋白质标准曲线 2 各步分离纯化的样品蛋白含量测定 表 2 4 倍稀释 样品 0 25ml 蒸馏水 0 75ml 装 订 线 P 2 3 4 实验名称 姓名 学号 根据测得的光吸收值 A500 查蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量 再进行样品 溶液的最终蔗糖 酶蛋白含量的计算 3 制备 3 5 二硝基水杨酸法标准曲线 以葡萄糖含量 mg 为横坐标 A520 值为纵坐标 制作葡萄糖浓度 吸光值标准曲线 4 各样品蔗糖酶的酶活力测定 表 4 200 倍稀释 4 倍稀释液 0 02ml 蒸馏水 0 98ml 根据测得的光吸收值 A520 查标准曲线得蔗糖酶活力 再进行样品 溶液的最终蔗糖酶活力的计算 五 实验数据记录和处理五 实验数据记录和处理 装 订 线 P 3 4 4 1 数据 已记录在实验步骤的表格当中 2 处理 实验名称 姓名 学号 六 实验结果和分析六 实验结果和分析 1 经计算 可得总表如下 体积 ml 蛋白浓度 mg ml 总蛋白 mg 活力 u ml 总活力 u比活力 u mg 样品 352 95103 2561 35214720 79 样品 303 2296 651 02153115 85 样品 9 59 7192 24588 5840 79 114 样品 5 50 8054 427598 04539 2121 8 2 分析 样品 的比活力在数值上比其他样品大太多 原因可能是柱层析时收集蛋白液的时机没有把握好 使得蛋白含 量较少 另一方面 可能是在测酶活力时稀释的时候所用的酶量过多 导致稀释造成的误差太大 当然 体积测量 分光 光度测量的过程中均存在误差 由数据还是可以看出蛋白酶在一系列的纯化操作中不断的更纯 杂蛋白被逐步的去除 七 实验讨论和心得七 实验讨论和心得 1 加入 Folin 酚试剂后 要迅速混匀 加一管混匀一管 使还原反应产生在磷钼酸 磷钨酸被破坏之前 2 在使用分光光度计的时候 要等等热平衡后再进行光吸收值的测定 而且作为空白对照的一直比色皿要始终插在分光光 度计内 每次换不同待测液后都要调零 比色皿使用时要注意其方向性 需配套使用 拿的时候不能触及光面 而且要保 证