第八章 外源化学物致癌作用

1,第八章 外源化学物致癌作用,2,肿瘤是一类严重危害人类生命健康的疾病,恶性肿瘤已成为人类死亡的第一位或第二位原因，每年全世界约有700万人死于癌症 恶性肿瘤在我国各种死因中排列第二位,3,肿瘤（tumor,neoplasm）： 有分裂潜能的细胞受致癌因素作用后发生恶性转化和克隆性增生所形成的新生物。,第一节 概述,4,恶性肿瘤： 癌（carcinoma） :上皮细胞来源的恶性肿瘤称为癌；如胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等。 肉瘤（sarcoma） :由间质细胞来源的恶性肿瘤称为肉瘤；如平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤等。,5,基底膜,毛细血管,转移瘤,粘附在肝脏毛细血管壁,外渗,上皮细胞中的良性肿瘤,结缔组织,穿透基底膜,侵入毛细血管,向毛细血管壁外渗出,增殖形成转移瘤,1/1000,6,癌的主要特点,不死性迁移性失去接触抑制接触抑制(contact inhibition)是指细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象，1954年，由艾伯克龙比(Aberchrombie)等首先发现。,7,癌细胞的生理特征,细胞周期失控具有迁移性接触抑制丧失（接触抑制：细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象）定着依赖性丧失 (正常真核细胞，除成熟血细胞外，大多须粘附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为定着依赖性anchorage dependence/贴壁依赖性，肿瘤细胞失去定着依赖性，可以在琼脂、甲基纤维素等支撑物上生长。)去分化现象 （是指一种已经分化或部分分化的成熟细胞反向褪去成熟细胞的特征，成为了一个分化程度较低的细胞。）对生长因子需要量降低代谢旺盛蛋白质合成及分解代谢都增强 线粒体功能障碍,8,肿瘤的发生过程是机体与环境之间发生复杂的、动态的交互作用的过程。,机体因素-遗传易感性、健康状况、心理因素 环境因素-食物、环境污染、职业和生活方式（如饮食习惯、吸烟等）、社会因素 一般估计，80%-90%的人类肿瘤与环境有关，其中主要是化学因素。肿瘤是可以预防的，要降低其发生率，首先必须认识、鉴定化学致癌因素和有害的生活方式，阐明其作用机理，然后采取措施，加以防治。,9,1775年，英国医师Percivall Pott报道阴囊癌，推测致癌物是煤焦油和烟炱 。首例化学致癌报道,10,化学致癌物（chemical carcinogen）能引起动物和人类肿瘤、增加其发病率或死亡率的化合物。 例如，黄曲霉毒素，苯并（a）芘及苯等。,化学致癌作用（chemical carcinogenesis）指化学物质引起或诱导正常细胞发生恶性转化并发展成为肿瘤的过程。,11,第二节 化学致癌过程,12,一、细胞癌变的多阶段学说 肿瘤的发生是一个长期的、多阶段、多基因改变的过程，具有多基因控制和多因素调节的复杂性。人类有些癌症潜伏期15-20年，动物诱导癌症出现需1-2周或2-12月。引发阶段（initiation ) 促长阶段( promotion ) 进展阶段( progression )癌基因、抑癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因等。,13,引发阶段（initiation）,是指在化学致癌物作用下，发生基因突变或表观遗传变异，导致异常增生的单个克隆癌细胞的生成，即成为突变细胞或称为活动细胞，从而引发致癌过程。具有引发作用的化学物质称为引发剂或启动剂。特点：化学致癌作用的第一步，将正常细胞转变为肿瘤细胞的起始步骤。通常是相对迅速的过程启动作用是不可逆的，它对DNA的损伤是细微的，很可能仅仅是转换、颠换、小缺失等基因突变。,细胞癌变的多阶段学说,14,不可逆经引发的“干细胞”在形态学上无法识别对外源性化学物质和其他化学因素敏感存在自发的引发作用(内源性） 剂量-反应关系良好，但很难确定阈值 需经细胞分裂“固定突变”引发作用必须发生在促长作用之前， “纯”引发作用在无促长时不导致肿瘤，引发剂的强度以促长阶段后发生的癌前病变来定量,引发阶段的主要特征,细胞癌变的多阶段学说,15,促长阶段（promotion）,化学致癌作用的第二阶段，是指促进引发形成肿瘤细胞分裂生长的过程。促长剂:具有促长作用的化学物质。特点：引发剂作用后，促癌物的作用是长期的、慢性的，才能引起肿瘤。促长剂的作用相对短暂，是可逆的，它有物种特异性，并有一定的阈值，低于阈值剂量，即不起促进作用。促长作用选择性地启动细胞增殖或细胞凋亡相对减少，从而实现克隆扩展。,细胞癌变的多阶段学说,16,促长阶段的主要特征,促长在早期阶段的改变是可逆的 促长剂通常是非致突变物，本身没有或仅有微弱的致癌作用，需要持续和反复暴露才能维持促长细胞群，即刺激细胞分裂，形成肿瘤。 促长剂的有效性仅出现在引发作用之后，促长剂的相对强度以能否有效地扩大引发细胞群来确定 只有促长剂的慢性作用，而没有引发剂作用也不会引起肿瘤。内源性促长剂可起“自发”促长作用剂量-反应显示有可测定的阈值 对饮食和激素等因素敏感,细胞癌变的多阶段学说,进展阶段（progression）,化学致癌第三阶段，是指在肿瘤形成过程中，在促长之中或之后，突变细胞表现出不可逆的遗传学改变，其标志为：遗传不稳定性增加和恶性转化。突变细胞在形态、功能、代谢和行为方面表现出肿瘤的特征：如生长加速、侵袭性、转移能力及生化、免疫性能改变。进展阶段：是指由良性肿瘤变为恶性肿瘤，并进一步演变为更具恶性表型或具有侵袭特征的肿瘤过程，主要表现为自主性和异质性增加，生长速度、侵袭性加强等恶性特征。当细胞开始失去维持核型稳定的能力并出现染色体畸变时，进入进展阶段。,细胞癌变的多阶段学说,18,进展阶段的主要特征,不可逆 核型不稳定性导致细胞基因组结构的形态学改变、染色体异常进展的早期阶段对环境因素敏感观察到良性或恶性肿瘤进展剂使已促长细胞进入该阶段,细胞癌变的多阶段学说,19,正常细胞,单个突变细胞：生长受限,引发,促长剂解除生长受限,大的克隆细胞群可能发生进一步突变,20,p-53 抑癌基因,22,二、遗传易感性与化学致癌 肿瘤的发生是环境致癌因素的作用与个体遗传易感性共同决定的，个体的遗传易感性又是由特定基因的遗传多态性（代谢酶基因多态性、DNA修复酶基因多态性）决定的，基因的遗传多态性的分子基础是单核苷酸多态性SNP。SNP：single nucleotide polymorphism, 单核苷酸多态性,24,第三节 化学致癌机制,25,体细胞突变学说（遗传损失机制学说）：即造成DNA损伤，这种损伤可以通过细胞分裂传给后代，引发肿瘤的遗传毒性机制 非突变致癌学说：即对DNA以外靶分子作用的非遗传毒性机制,化学致癌机制分为：,26,体细胞突变学说理论的证据：1.致癌物代谢活化后生成的DNA加合物诱导基因发生突变；2.大多数致癌物在致突变实验中呈阳性；3.DNA修复缺陷可以导致肿瘤发生；4.在许多肿瘤组织中发生染色体畸变或基因组不稳定5.肿瘤细胞来源于单个突变细胞克隆；6.癌基因的突变及抑癌基因突变或缺失在肿瘤细胞中普遍存在，而且突变的基因型可传递给子代细胞。从本质上说，肿瘤是细胞中多基因突变累积的结果。,一、体细胞突变学说,27,（一）DNA加合物（DNA adduct)致癌物多数具有遗传毒性，具有遗传毒性的致癌物一般都是亲电子剂亲电剂+DNA亲核物DNA加合物DNA损伤部分细胞恶性转化肿瘤DNA加合物在化学致癌作用过程中起到关键作用，是引起肿瘤的直接原因之一，可作为人类接触环境污染物的生物学标志。（接触标志物&效应标志物）,28,（二）原癌基因、癌基因及抑癌基因,1.原癌基因（pro-oncogene）：指机体内正常细胞所具有的能致癌的遗传信息。即癌基因的原型。正常情况下呈静止状态，对细胞无害且具有重要生物学功能（调控细胞生长分化，促进细胞分裂、增殖等）。,29,一些原癌基因, 原癌基因 功能 相关肿瘤 sis 生长因子 Erwing网瘤 erb-B 受体酪氨酸激酶，EGF受体 星形细胞瘤、 卵巢癌、 肺癌、胃癌、唾腺癌 ras G-蛋白 肺癌、结肠癌、膀胱癌等 src 非受体酪氨酸激酶 罗氏肉瘤 Abl-1 非受体酪氨酸激酶 慢性髓性白血病 raf MAPKKK，丝氨酸/苏氨酸激酶 腮腺肿瘤,30,2.癌基因（oncogene）：是指一类具有诱发恶性转化能力的潜在基因（在自然或实验条件下）。 1）它们是化学致癌物作用的主要靶分子 2）在细胞癌变过程中起关键作用 3）实质上是一类被激活的基因，所指导合成的蛋白质能够促成细胞恶性表型的形成已经发现的癌基因有100多种致癌物 原癌基因 癌基因 癌变,点突变,31,己知的细胞癌基因分为下列四类:1 蛋白激酶类2 信息传递蛋白类3 生长因子及其受体类4 核内蛋白类,32,3.抑癌基因（anti-oncogene）：是正常细胞分裂、生长、增殖的负性调节因子，其编码的蛋白质能够降低或抑制细胞分裂活性。或称为抗癌基因(anti-oncogene)肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene）抑癌基因失活肿瘤细胞增殖失控。遗传毒性致癌物主要通过：,33,抑癌基因主要有以下功能:,诱导终末分化维持基因稳定触发衰老，诱导细胞程序性死亡调节细胞生长 抑制蛋白酶活性改变DNA甲基化酶活性调节组织蛋白酶活性调节血管形成促进细胞间联系,34,一些抑癌基因及其功能, 抑癌基因 功 能 相关肿瘤Rb 转录调节因子 RB、成骨肉瘤、胃癌、 SCLC、乳癌、结肠癌 P53 转录调节因子 星状细胞瘤、胶质母细胞瘤、 结肠癌、乳癌、成骨肉瘤、 SCLCWT 负调控转录因子 WT、横纹肌肉瘤、肺癌、 膀胱癌、乳癌、肝母细胞瘤NF-1 GAP， 神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、 ras GTP酶激活因子 雪旺氏细胞瘤、神经纤维瘤DCC 细胞粘附分子 直肠癌 p21 CDK抑制因子 前列腺癌,人类肿瘤中50%以上存在p53基因异常,35,（三）DNA修复与化学致癌正确修复：受损的DNA完全回复原有的结构与功能，不发生突变 （无差错修复）错误修复：经修复的DNA部分仍可能在结构和功能上存在缺陷，细胞虽能生存，但出现突变（“易错”修复） DNA损伤-错误修复-DNA突变-肿瘤,36,二、非突变致癌机制(表观遗传致癌学说),在正常体细胞转变为癌细胞过程中，有时基因结构即DNA序列并未改变，而发生了基因外的一些变化，这些变化影响基因调控，使基因出现不正常的关闭和开放。表观遗传学（epigenetics）是研究从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴的遗传学分支。表观遗传信息提供何时、何地以及如何应用遗传信息的指令，在时空顺序上控制基因的表达，它不涉及DNA序列的改变，但又可以通过细胞分裂遗传给子代细胞。,表观遗传修饰网络包括：,DNA甲基化组蛋白修饰染色质重塑非编码RNA,非突变致癌机制(表观遗传致癌学说)包括：, 表观遗传调控失常致癌 细胞异常增生致癌 内分泌激素失衡致癌 免疫抑制致癌 过氧化酶体增殖剂激活受体PPAR,39,第三节 化学致癌相关的分子事件,一、基因突变二、端粒调控与细胞永生化三、细胞周期调控紊乱四、细胞凋亡与肿瘤发生,40,一、基因突变癌基因抑癌基因DNA修复酶基因细胞凋亡调控基因维持基因组稳定的基因这些基因的突变与肿瘤的发生密切相关,化学致癌相关的分子事件,41,二、端粒调控与细胞永生化端粒（telomere)： 真核染色体的末端结构，为一特定的DNA-蛋白质复合体结构。随细胞分裂逐渐缩短。端粒酶(telomerase)：一种反转录酶，由蛋白质和RNA两部分组成核糖蛋白复合体，其中RNA是一段模板序列，指导合成端粒DNA的重复序列片段。端粒酶被激活，可使细胞不断增值分裂成为永生化细胞。端粒酶的活化维持了端粒缩短和延伸的动态平衡。如端粒丢失，削弱染色体的稳定性及其功能，进而影响细胞活力。,化学致癌相关的分子事件,42,原代培养的人上皮细胞在体外分裂40-60次后就停止生长，进入老化阶段M1期，如此时细胞内的抑癌基因p53和Rb失活，细胞就能暂时逃脱老化的威胁而继续分裂，但端粒是随着细胞分裂次数的增加而逐渐缩短，这些细胞最终进入以死亡为特征的M2期，如此时端粒酶被激活，细胞就获得了不断增生分裂的能力而成为永生化细胞。端粒假说：抑癌基因p53和Rb的失活以及端粒酶的激活是细胞获得永生化的必要条件,化学致癌相关的分子事件,43,端粒酶的意义,寻找端粒酶抑制剂，为抗肿瘤治疗提供新药物寻找端粒酶激活剂，为维持细胞活力和阻止细胞衰老开拓新途径,化学致癌相关的分子事件,44,三、细胞周期调控紊乱细胞增生过程由细胞周期（cell cycle）来完成。细胞周期分为G1 S G2 M细胞周期调控的核心成员：细胞周期素（cyclin）、细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK)和CDK的抑制性蛋白（CDKI)细胞周期调控依赖两大机制：细胞周期驱动机制 细胞周期监控机制,化学致癌相关的分子事件,45,细胞周期监控包括：DNA损伤感应、细胞生长阻滞、DNA修复和细胞凋亡启动。如果细胞周期调控的某些重要因子功能障碍，细胞周期的驱动力增强，并使正常的监控能力下降，就造成细胞周期调控失常，细胞进入失控性生长阶段。注意：某些癌基因或抑癌基因也是细胞周期调控过程的重要成分，如p53、Rb、p21、p16等,化学致癌相关的分子事件,46,四、细胞凋亡（apoptosis）与肿瘤 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传因素的控制自动结束生命的过程，是一种自然的生理过程。它是机体为了清除多余的、有害的、已经完成使命的细胞，维持机体的稳态所启动的系统。 细胞凋亡的调控机制： 促进凋亡:如p53,Rb,p16,Bax 抑制凋亡:如c-Myc, Ras, Src, Bcl-2正常凋亡过程受到干扰，本该清除的细胞保留下来，受损细胞中携带的突变得以固定和传递。如果某些药物可诱导细胞凋亡也为肿瘤治疗提供了一个方向。如 砒霜，我国学者应用治疗早幼粒细胞白血病APL获得成功，其重要机制就是诱导细胞凋亡。,化学致癌相关的分子事件,47,第四节 化学致癌物的分类,48,一、根据对人和动物的致癌性分类,国际癌症研究中心（IARC）根据对人类研究资料、动物资料和遗传毒理学资料，将致癌因素分为四类：,组1:对人类是致癌物（107种） 对人类致癌性证据充分属于本组 组2：对人类是很可能或可能致癌物 组2A：对人类很可能是致癌物（58种）对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分 组2B：对人类是可能的致癌物（249种） 对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据并不充分；或指对人类致癌性证据不足，对实验动物致癌性证据充分。 组3：可疑对人类致癌（512种）现有证据不能对人类致癌性进行分类组4：对人类可能是非致癌物（1种）己内酰胺,49,二、按化学致癌作用模式分类,根据化学致癌物引起癌变的机制，分为：直接致癌物（direct acting carcinogen）间接致癌物（indirect acting carcinogen）促癌剂（tumor promotin agent）,1）直接致癌物：本身直接具有致癌作用，在体内不需代谢活化即可致癌。如各种烷化剂，大多为亲电子反应物。以及内酯类、氮芥、铂的配位络合物；金属镍、铬、镉、砷、钛或其盐类2）间接致癌物：本身不直接致癌，必须在体内经代谢活化，所形成的代谢产物具有致癌作用。如多环芳烃、芳香胺类3）促癌剂：本身不致癌，但对致癌物有促进作用。如苯巴比妥、色氨酸、糖精、佛波酯TPA、巴豆油、煤焦油中的酚类、卤代烃、二噁英、DDT等。此外，助癌剂、助致癌物（co-carcinogen):本身无引发作用和促长作用，但能促进引发作用和增强促长作用。如 乙醇、二氧化硫。,按化学致癌作用模式分类：,51,前致癌物 近致癌物 终致癌物前致癌物（precarcinogens): 本身并不直接致癌，必须在体内经代谢转化才具有致癌作用，尚未代谢活化的形式，即母体化合物 近致癌物(proximate carcinogens): 指前致癌物经代谢活化过程形成的中间产物，必须进一步代谢活化才具有致癌作用的物质 终致癌物(ultimate carcinogens): 不需代谢活化的直接致癌物和间接致癌物经过代谢转化最后产生的活性代谢产物的统称,代谢酶,代谢酶,间接致癌物（第六版）,52,完全致癌物：既有引发作用又有促长作用的致癌物，如多环芳烃、芳香胺、亚硝胺、致癌病毒等。不完全致癌物：仅有引发作用（第六版）根据化学致癌物引起癌变的机制，分为：遗传毒性致癌物和表观遗传毒性致癌物（分法不准确）,53,第五节 化学致癌物筛查的基本方法,定量构效关系（QSAR)分析遗传毒性试验细胞恶性转化哺乳动物致癌试验促癌剂的检测转基因或基因敲除动物在致癌物筛查中的应用人群肿瘤流行病学研究,54,致癌效应是一种严重的毒性后果，对化学物致癌性的评价是一项重要、慎重，而又复杂费时的工作 化学致癌物的判别包括两方面证据： 1）人群流行病学调查 2）动物试验结果通常先进行构效关系分析、致突变组合试验、细胞恶性转化试验，如果阳性进一步进行下一阶段试验。,55,一、定量构效关系分析,定量构效关系（QSAR)：是利用理论计算和统计分析工具来研究化合物结构与其生物学效应之间的定量关系。一般先从化合物的化学结构特点来评估其潜在的致癌危险性。,56,二、遗传毒性实验,许多化学致癌物具有致突变作用，因此目前致突变试验是毒理学安全评价中最多的检测项目。通过致突变试验筛检致癌物。遗传毒性致癌物可能有多种致癌机制，因此要求：试验组合尽可能反映较多的遗传学终点。致突变试验的优缺点：优点：根据化学致癌物的致突变性与致癌性之间关联，检出具有遗传毒性的致癌物，特异性高；方法简单、快速、费用低、无需特殊检测仪器缺点：无法检出非遗传毒性致癌物,57,Ames试验 大肠杆菌回复突变试验 大肠杆菌DNA修复试验 果蝇伴性隐性致死试验 哺乳类细胞体外染色体分析哺乳类细胞体外SCE试验 V79细胞体外HTRP突变试验 啮齿动物骨髓细胞染色体分析（或微核试验） 啮齿动物显性致死试验,常用的遗传毒性实验有：,58,三、细胞恶性转化试验,是指外源因素对体外培养的细胞所诱发的恶性表型改变，包括：细胞形态、细胞增殖速度、生长特性、染色体畸变等变化，当细胞接种在裸鼠皮下可形成肉眼可见的肿瘤。,目的：是了解体外培养细胞接触受试物后，细胞是否癌变。(如细胞生长自控丧失、接触抑制丧失、细胞排列紊乱或灶性生长)其观察内容包括：生长自控能力、细胞形态、细胞生长能力、生化表型以及移植于动物体内形成肿瘤的能力等。,59,细胞恶性转化试验的优缺点：优点：可检出遗传毒性与非遗传毒性致癌物缺点：所检出的大多数为形态转化或恶性前期转化的细胞，但不一定形成肿瘤，对其阳性结果应慎重，它提示受试物具有致癌的可能性，但它不能代替动物试验作出肯定的结论,细胞恶性转化试验采用的细胞：,原代细胞：常用叙利亚仓鼠胚胎细胞(SHE细胞)、人类成纤维细胞、小鼠皮肤或大鼠支气管上皮细胞等。细胞系：常用BALB/C-3T3、C3H10T1/2和BHK-21病毒感染细胞：RLV/RE细胞（劳舍尔白血病病毒感染的Fisher大鼠胚胎细胞）或SAT/SHE细胞（猿猴腺病毒感染的SHE细胞）试验终点是恶性变的细胞。,61,观察终点：恶性变的细胞,恶性变的细胞表现如下：1.形态：细胞偏大，且大小不等；核大而畸形，染色质深染而粗糙，核浆比例倒置，核膜粗厚，核仁增生而肥大；核仁核胞浆因RNA增多而偏酸性，呈嗜碱性染色而偏蓝；多见核分裂现象。2.接触抑制消失：它的克隆不是细胞排列有序的单层细胞，而是多层细胞且排列紊乱。3.生长速度的改变。4.生长特性的改变：软琼脂集落试验5.裸鼠荷瘤试验：,62,63,四、 哺乳动物致癌试验,包括：短期致癌试验，长期致癌试验,（一）动物短期致癌试验（应用较多的有4种）,小鼠肺肿瘤诱发试验小鼠皮肤肿瘤诱发试验大鼠肝转变灶试验雌性大鼠乳腺癌诱发试验,国际上称为中期致癌试验,小鼠肺肿瘤诱发试验染毒途径常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，一般30周可结束实验，观察肺肿瘤的发生。较敏感的小鼠为A系小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为乌拉坦，促长剂为二丁基羟基甲苯(BHT)。小鼠皮肤肿瘤诱发试验于小鼠皮肤局部连续涂抹受试物，以观察皮肤乳头瘤和癌的发生，一般20周可结束实验，较敏感的小鼠为SENCAR小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为致癌性多环芳烃，促长剂为佛波醇酯(TPA)。,动物短期致癌试验,65,大鼠肝转变灶试验对大鼠进行肝大部切除术后，给以受试物，观察肝转化灶生成，一般可在814周结束实验。肝转化灶是癌前病变，有-谷氨酰转肽酶活性升高，G6P酶和ATP酶活性降低，以及铁摄取能力降低。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为二乙基亚硝胺(DEN)，促长剂为苯巴比妥(PB)。雌性大鼠乳腺癌诱发试验一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠)，实验周期为6个月。,动物短期致癌试验,66,此四个试验不是成组试验，应根据受试物的特点选择使用。此四个试验任一试验得到阳性结果的意义与长期动物致癌试验相似，但阴性结果并不能排除受试物的致癌性。,动物短期致癌试验,67,优点：在有限的短时间内完成而不是终生试验，其观察的靶器官也限定为一个而不是全部器官和组织。其试验阳性结果意义与长期动物致癌试验相当缺点:仅适用于较小范围内的化学物质类型，其试验阴性结果意义较差。,哺乳动物短期致癌试验优缺点：,68,（二）、哺乳动物长期致癌试验,优点：1）可严格控制试验条件 2）缩短试验周期缺点：试验结果外推至人尚存在不确定性 动物选择动物数量计量设计实验期限与染毒时间结果的观察、分析与评定,哺乳动物长期致癌试验,69,1、动物选择,对诱发肿瘤的易感性：a.物种、品系：对诱发肿瘤的易感性，要求用两种实验动物，常规用大鼠和小鼠（较敏感、自发肿瘤率低、生活力强、寿命较长的品系）靶器官特异性：大鼠-肝癌、小鼠-呼吸道或肺肿瘤、金黄地鼠-膀胱癌b.年龄：刚断乳的动物（保证足够的染毒和发生癌症的时间，幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善，对致癌作用较为敏感）c.性别:接近人类情况，雌雄各半（若靶器官为性腺，单一性别） d.数量：一般每组至少有雌雄各50只（较一般毒性实验多）希望在出现第一个肿瘤时，每组还有不少于25只动物。 e.当对照组肿瘤的自发率高时，动物数增加,哺乳动物长期致癌试验,2、剂量设计,1个对照组(除不给受试物外，其他条件均与试验组相同)3个染毒剂量组 : I无作用剂量组:不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。但应高于人的接触剂量，一般不低于高剂量的10 II阈剂量组:中剂量组介于高、低剂量之间。 III发生肿瘤的剂量组(最高剂量组)：最大耐受剂量MTD，由90天毒性试验来确定的，并且不引起死亡及可能缩短寿命的中毒症状或病理损伤，与对照组相比，体重下降不超过10。,较低剂量为前一级高剂量的1/3至1/2。必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物化学结构相近。,哺乳动物长期致癌试验,71,3、试验期限与染毒时间,原则上实验期限要求：长期或终生一般情况下，小鼠最少1.5年、大鼠2年，可能时分别延长至2年和2.5年。通常从实验开始至实验结果反复多次染毒。,哺乳动物长期致癌试验,72,4、结果的观察、分析和评定,一般观察：体重、外观、活动、摄食是否正常，肿瘤出现的时间、部位、数目、性质、大小、死亡时间等。（1）肿瘤发生率： （2）多发性： （3）潜伏期：以上3项指标只要有1项存在剂量反应关系，就是阳性结果。如染毒组出现对照组没有的肿瘤类型，也可作为阳性结果。,哺乳动物长期致癌试验,73,（1）肿瘤发生率：,是本试验最重要的指标，需要计算肿瘤总发生率、恶性肿瘤发生率、各器官或组织肿瘤发生率和恶性肿瘤发生率，以及各种类型肿瘤发生率。,肿瘤发生率指一组实验动物中发生肿瘤动物数与该组有效动物数之比有效动物数指最早出现肿瘤时该组存活动物数,哺乳动物长期致癌试验,74,（2）多发性：,肿瘤多发性：指一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。是化学致癌的显著特征。一般计算每一组的平均肿瘤数。有时还可计算每一组中出现2个、3个或多个肿瘤的动物数或比例。,哺乳动物长期致癌试验,75,（3）潜伏期：,潜伏期：通常用各组第一个肿瘤出现的时间作为该组潜伏期。其局限性是只适用于能在体表观察的肿瘤，如皮肤肿瘤和乳腺肿瘤等。对于内脏肿瘤的潜伏期，则需分批剖杀，计算平均潜伏期。,致癌指数=肿瘤发生率/平均潜伏期肿瘤发生率越高、平均潜伏期越短，该受试物的致癌性才越强。利用致癌指数可对不同化学物致癌能力进行比较。,哺乳动物长期致癌试验,76,结果评定：,阳性结果的判定：染毒组与对照组作显著性检验，若存在剂量反应关系，并与对照组差异显著时，为阳性结果。 若染毒组出现对照组未出现的肿瘤类型，也做阳性结果，但需要对照组的历史资料。阴性结果的判定：应满足实验设计的最低要求：两个物种、两种性别、至少3个剂量水平，且其中1个接近最大耐受量（MTD)，每组有效动物数至少50。即使符合最低要求得到阴性结果，仅表明该受试物在特定染毒剂量下不引起肿瘤净增率超过对照组肿瘤净增率。,哺乳动物长期致