工作汇报帕金森

XXX对帕金森病模型的保护作用及其机制的实验研究,1,汇 报 内 容,2,课题背景资料,英国内科医生詹姆斯帕金森博士最早系统描述了帕金森病。为引起人们对这种疾病的重视，自1997年开始，帕金森博士的生日,每年的4月11日被确定为“世界帕金森病日”(World Parkinsons Disease Day)。,帕金森病,3,课题背景资料,4,帕金森病（病理特征之一）,The common feature of PD is the degeneration of the neural connectionbetween the substantia nigra (SN) and the striatum ( Wooten,1997), two essential brain regions in maintaining normal motor function (Fig. 1 ).,课题背景资料,5,课题背景资料,帕金森病（病理特征之一）,6,课题背景资料,黑质尚存神经元的胞浆内出现嗜酸性包涵体，亦称Lewy小 体( LBs) ， LBs主 要 由- 突 触 核 蛋 白 聚 合 而成。,帕金森病（病理特征之二）,7,课题背景资料,因此寻求能延缓、阻止甚至逆转神经变性过程的药物，保护神经元的损伤已成为临床期望所在,8,课题背景资料,帕金森病（影响因素）,9,10,课题背景资料,百草枯（慢性染毒),与PQ 导 致 的急性肺损伤不同，长 期 低 剂 量 的 暴 露 可 能 会 损 害中枢神经导致震颤麻痹；PQ结构与公认的神经毒素1-甲基-4-苯基1, 2, 3, 6四氢吡啶( 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridin, MPTP) 的活性代谢产物1-甲基-4-苯基吡啶离子( 1-methyl-4-phenyl pyridinium cation, MPP+ )极为相似，亦具有与MPTP相似的选择性，破坏黑质致密部多巴胺能神经元的作用, 产生类似于PD的症状,而对胆碱能系统无明显影响。,11,课题背景资料,PQ引起PD的可能毒性机制,12,PQ 可 能 通 过 下 述 3种 途 径导致或诱发帕金森病,课题背景资料,一、引发多巴胺持久性 外 溢 和 多 巴 胺 合 成 减 少,氧化亚硝酸离子,13,多巴胺能神经元可摄取血液中的酪氨酸，后者在胞浆内被酪氨酸羟化酶（TH）催化成为多巴（主要为L型），再经多巴脱羧酶(DDC) 作用而生成多巴胺（DA），如图一所示。,课题背景资料,多巴胺的合成,14,课题背景资料,二、PQ通过线粒体复合酶I电子传递链影响能量合成,PQ 可 能 通 过 下 述 3种 途 径导致或诱发帕金森病,15,课题背景资料,三、上调 突触核蛋 白 并 形 成 聚 合 体,突 触 前 聚集的大量 -synuclein蛋白是PD 患者神经 元 内 的LBs的主要成分，而LBs 可 能 是 由 于 -synuclein基 因 与PQ相互作用 所 产 生 的。,PQ 可 能 通 过 下 述 3种 途 径导致或诱发帕金森病,16,课题背景资料,百草枯可能诱导动物模型帕金森病的发生,17,本课题拟从整体和离体水平研究XXX 对 PD 模型中多巴胺能细胞的保护作用及其机制。,课题思路,整体,离体,18,造PD 模型,课题思路,DA 含量的测定,病理形态学观察,目的：通过此实验筛选合适造模剂量。,19,行为学检测(悬挂实验)：正常小鼠具有攀爬能力,这需要适当的握力与运动协调性,我们采用悬挂实验来检测小鼠给予PQ后的运动功能障碍。实验中将小鼠前爪悬挂于距地面30cm水平放置的金属丝上,记录从开始悬挂到落地前的时间。将悬挂时间按下述标准评分:0s4s 评0分,5s9s 评1分,10s14s评2分,15s19s评3分,20s24s评4分,25s29s评5分,超过30s评6分,1、每天观察每只小鼠是否有震颤、竖毛、前腿抬高、竖尾、动作缓慢、减少等异常行为,2、悬挂法,行为学观察,DA 含量的测定,HPLC法测黑质纹状体中DA含量测定。,病理形态学观察,取中脑黑质，常规制片，连续冠状切片，分别进行焦油紫染色和TH免疫组化染色，观察TH阳性细胞的形态变化。 用图像分析仪分别对Nissl染色细胞、TH免疫组化染色阳性神经元进行计数，透射电镜观察神经元的超微结构变化。,课题思路,20,探讨 XXX 对PQ 致 C57BL/6 小鼠多巴胺能神经元损伤的保护作用,课题思路,初步设想：设计阴性对照组、百草枯组、XXX处理组（2-3组），根据XXX化合物特点决定给药方式、给药周期以及给药频率，观察行为学指标，并进行病理形态学观察，进行DA测定，来探讨XXX对PQ致C57BL/6 小鼠多巴胺能神经元损伤的保护作用。,21,XXX 对多巴胺能细胞的保护作用机制（抗凋亡作用及其机制研究）,课题思路,22,课题思路,XXX 对多巴胺能细胞的保护作用机制（抗凋亡作用及其机制研究）,23,如果上边的实验成立，那么XXX 保护 PC12 细胞免受 PQ神经毒性作用的具体信号通路并不是十分清楚。本实验拟通过 PQ处理 PC12 细胞制备 PD 细胞模型，研究XXX对 PQ所致PC12 细胞损伤的保护作用的相关信号转导通路。,课题思路,有文献报道：PI3K/AKT、ERK信号转导通路在神经元保护中有着非常重要的作用：,24,课题思路,25,存在疑问,26,谢谢大家提前祝大家圣诞元旦快乐,27,Backups,28,29,30,31,课题思路,有文献报道：PI3K/AKT、ERK信号转导通路在神经元保护中有着非常重要的作用： 磷酸肌醇 3 激酶(PI3K)/Akt 信号转导通路是近年来发现的一条参与细胞增殖调控的重要信号通路。也是在各种损伤应激条件下发挥保护作用的一条重要信号通路，它可以促进氧化应激条件下心肌细胞和 PC12 细胞的存活。PI3K 和 Akt 是该通路的中心环节。 糖原合成酶-3（Glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是Akt下游的一个激酶，参与调解细胞代谢过程的许多环节，包括糖原合成。GSK-3在静息细胞呈组成性激活，细胞外刺激可通常通过一些激酶引起GSK-3N末端的丝氨酸残基的磷酸化可导致其活性抑制，Akt可以通过磷酸化GSK-3抑制其活性。GSK-3可以参与调解PC12细胞的活性：转染组成性激活的GSK-3可以诱导PC12细胞凋亡；而转染无活性的GSK-3可以抑制凋亡。 胞外信号调节激酶（extracellular- signalregulated kinase，ERK）信号转导通路被认为是与细胞增殖、分化和促进细胞存活密切相关的信号转导途径，与 PI3K 通路类似，都可以在病理条件下保护促进神经元存活。,32,MPP通过多巴胺转运体（DAT）进入可以直接PC12细胞，能选择性抑制线粒体复合体I 的活性， 破坏线粒体的呼吸功能，导致PC12细胞内ROS的形成、线粒体功能障碍引起一系列的继发性改变，最终导致细胞变性、死亡。ROS形成后通过破坏细胞膜脂质、裂解DNA进而导致凋亡。,33,34,PQ其有较强氧化能力, 在NADPH-细胞色素P-450还原酶、NADPH-细胞色素C还原酶、线粒体复合酶I等多种生物酶催化下发生还原反应生成PQ单阳离子自由基(PQ+) 及超氧自由基（O2-）。超氧自由基能从其他脂质膜中去掉氢原子, 引发一系列级联生化效应, 生成活性氧簇( reactive Oxygen species, ROS), 主要有过氧化氢( hydrogen peroxide,H2O2）和羟自由基，引发细胞毒性效应, 致膜流动性降低, 通透性增大、脆性增加, 功能下降, 使细胞难以维持生理功能, 对其他自由基的攻击更加敏感。 黑质部位是锥体外系通路的重要环节, 具有较高的氧化代谢率, 富含高密度的不饱和脂肪酸, 特别易受自由基的攻击,对PQ的毒性十分易感。百草枯所致PD样小鼠黑质部位存在严重的氧化应激反应, 大量氧自由基生成, 使得超氧化物歧化酶( superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione-Px, GSH-Px)过度消耗,多巴胺能神经元抗氧化损伤的能力明显下降。丙二醛为体内脂质过氧化反应的最终代谢产物, 组织丙二醛水平间接反映体内氧自由基的代谢状况, 也反映了组织受自由基攻击程度。,PQ引起PD的可能毒性机制,课题背景资料,35,PQ可经 由 血 脑 屏 障(blood brain barrier ，BBB ) 内的中性氨基酸载体主动摄取至中枢神经系统，百 草 枯的结构同MPP+ 相 似，可 以 直 接 通 过BBB ，但 是 速 度慢、量也少。在 递 质 转 运 蛋 白如多 巴 胺 转 运 体(dopamine transporter，DAT ) 、L-氨 基酸转 运 体 的 帮 助 下 PQ能够更容易通过BBB ，达 到 其靶作用位点 。若同 时 摄 入 一 些 小 分 子 氨 基 酸( 如 缬 氨酸苯丙氨酸) 或 左 旋 多 巴，可 以 改 变PQ 的 摄 入 率，从而阻止PQ 在脑内的蓄积及其神经毒性。 PQ通过能量依赖转 运 入 纹 状 体 内，这 与 PQ在 肺内的聚胺