人类疾病模型与模式化实验动物饲料浅谈

,2015年6月28日,成都达硕,模式化实验动物饲料是确保实验动物疾病造模成功的关键因素之一。,实验动物,标准化的实验动物饲料是维持该“试剂”标准化的重要基础。,实验动物被誉为活试剂，是一切疾病模型、毒理研究的载体。,缺VD3饲料,缺赖氨酸饲料,缺钙 饲料,高钙 饲料,高铁 饲料,高蛋白质饲料,缺铬 饲料,模式化实验动物饲料,食源性肥胖模型饲料,胰岛素抵抗/糖尿病模型饲料,非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型饲料,动脉粥样硬化模型饲料,高血压模型饲料,肥胖,食源性肥胖症,高脂饲料诱导的食源性肥胖症（DIO）,遗传与环境因素是肥胖的主因，饮食因素是诱发肥胖的主要环境因素。啮齿类动物在高脂诱导下很容易长胖，是非常有效的食源性肥胖症（Diet-Induced Obesity, DIO）的研究工具1, 2。,肥胖,食源性肥胖症（DIO）,高脂饲料诱导的DIO,DIO诱导饲料:3045kcal%脂肪（粗脂肪1318%，粗蛋白1820%）高脂日粮 DIO对照饲料:1011kcal%脂肪（粗脂肪45%，粗蛋白1820%）低脂日粮,饲喂该高脂料68周能引起大鼠、小鼠营养性肥胖，且大鼠伴随高血脂和高血糖，小鼠伴随高胆固醇和高血糖，为人类营养性肥胖伴发高脂血症、高胆固醇血症和高血糖提供了研究方便【3-4】。,食源性肥胖造模常用饲料配方,动物模型,虽然大多数啮齿类动物在摄食高脂饲料后都会发胖，但是在体重增加、葡萄糖耐受水平、胰岛素抗性、甘油三酯水平及其他生理指标上存在品系差异性。,小鼠,高脂饲料近交易感品系小鼠：C57BL/6、AKR。 用58Kcal%脂肪的高脂饲料饲喂这两种小鼠，体重增加相同，但C57BL/6比AKR对葡萄糖更加耐受13 。 表现单一肥胖抵抗的小鼠品系：SWR/J、A/J14, 15 。,封闭群的SD大鼠与Wistar大鼠是常用DIO品系，特别是SD大鼠。 SD大鼠对32或45Kcal%脂肪的高脂饲料存在个体差异性，可用于肥胖 （DIO）与肥胖抵抗（DR）的研究16, 17。,大鼠,18,如图所示，随着周龄的增加，DIO组与DR组的大鼠体重差异增大 18。,研究发现，高脂或高脂高糖饲料造模结果只有部分可诱导成肥胖，约有一半的动物存在食物抵抗，不能诱导成营养性肥胖19。,幼年动物对高脂食物更敏感，而年龄为70d 75d后的动物对高糖食物所诱导的动物体重增加敏感19 。 高脂食物所诱导的肥胖还存在性别差异，这种差异主要表现为脂肪分布部位的不同。雌性动物在腹内及生殖器官周围的脂肪垫所占比例大于雄性，而在前肢的比例较雄性小19 。,小结,食源性肥胖造模以有很多成功的经验，对肥胖模型饲料的研究至今已有约20年历史，形成了较为成熟的方法。肥胖症研究的混杂因素很多，除了模型饲料的脂肪水平外，还包括实验动物品种、品系、性别、年龄等，而且约有50%的动物存在食物抵抗。所以要得到足够数量的模型动物，实验动物样本的数量需放大至少1倍。,糖尿病,胰岛素抵抗/糖尿病,高果糖/蔗糖饲料对啮齿类动物血脂水平与胰岛素抵抗的影响,胰岛素抵抗（IR）是指胰岛素靶组织对内源性或外源性胰岛素的敏感性与反应性降低。IR不仅是2型糖尿病的发病基础，并且也与肥胖、高血压和心血管疾病等密切相关。 目前IR模型以鼠类模型为主，按照建立方法的不同可以分为遗传性模型、基因改造模型、诱发模型，其中诱发模型由于复制成功率高、稳定、复制方法简单、价格低、周期短，在国内得到了广泛应用20。,IR常用造模动物及模型饲料,*,*,*,*,*,*,*,注：SD大鼠，分别用对照料和不同加工方式高脂料饲喂6周后测定。Nor对照组、H1高脂料1所用原料混匀，100oC烘烤2h；H2高脂料2白糖+鸡蛋混匀，100oC水蒸2h，再与其余原料混匀，继续100oC水蒸2h；H3高脂料3白糖+鸡蛋混匀，100oC水蒸2h，再与其余原料混匀， 100oC烘烤2h ；3组高脂料配方相同25。,糖与蛋白充分混匀并加热的高热量饲料更易于诱发IR,美拉德反应(Maillard reaction):是还原糖的羰基与氨基酸的氨基之间在加热时发生的非酶催化的褐变反应。该反应是法国化学家Louis-Camille Maillard于1912年在将甘氨酸与葡萄糖混合加热时发现的， 也称为羰氨反应。该反应生成一系列的的糖化产物（AGEs）。人类及动物实验研究均表明食入AGEs的量影响血AGEs水平，而高AGEs血症可以影响机体对胰岛素的敏感性，导致IR，促进糖尿病及其并发症的发生、发展25。,非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。特点是人体自身能够产生胰岛素，但细胞无法对其作出反应，使胰岛素的效果大打折扣。,型糖尿病,二型糖尿病造模动物及模型饲料,刘亚平81等2008年通过对Wistar大鼠的研究发现： 通过给大鼠饲喂高脂高糖饲料（基础料60%+猪油10%+蛋黄粉10%+蔗糖20%）8周，再结合小剂量注射链脲佐菌素（STZ，30mg/kg），可成功建立雄性大鼠2型糖尿病模型，而同等剂量，雌性模型需两次注射STZ。雄、雌性糖尿病大鼠模型都具有高血糖、脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗的特点,造模成功率及稳定性与性别有关，雄性大鼠较雌性大鼠成模率高，稳定性好，且耗时更短。,汤球（2011） 82在雄性SD大鼠中研究发现： 给雄性SD大鼠饲喂高脂高糖饲料4周，第一次腹腔注射STZ30mg/kg，再过4周后第二次注射STZ40mg/kg，能够成功制备T2DM大鼠模型，造模成功率为81.9%，死亡率为18.1%。,小结,食物诱发的胰岛素抵抗模型复制成功率高、稳定、可靠，同时复制方法简单、价格低廉、周期短，在国内得到了广泛应用。目前主要的胰岛素抵抗模型饲料有：高脂饲料、高糖饲料、高脂高糖饲料。二型糖尿病造模的主要方法是：用高脂高糖饲料+小剂量的STZ注射。,脂肪肝,脂肪肝,非酒精性脂肪肝（NAFLD）non-alcoholic fatty liver diaease,NASH与人类肥胖症、胰岛素抵抗、血脂异常及II型糖尿病的发病密切相关27。大部分肥胖症患者都伴有肝脏脂肪变性28,29。,非酒精性脂肪肝模型动物,NAFLD动物模型采用的实验动物主要有大鼠、小鼠、沙鼠、家兔、小型猪等，但主要以大鼠造模最为常见80。,非酒精性脂肪肝模型饲料,啮齿类动物的脂肪肝可以用饲料进行诱导。主要有3种饲料：MCD饲料（蛋氨酸-胆碱缺乏饲料）、CD饲料（胆碱缺乏饲料）和HFD饲料（高脂饲料）。,给SD大鼠饲喂MCD饲料2-4周可诱导严重非酒精性脂肪肝表型（肝脏脂肪变性、肝炎和肝纤维化） 30,31；体重减少，不会引起胰岛素抵抗 32,33 。,MCD饲料（蛋氨酸胆碱缺乏饲料）：,MCD饲料诱导的肝脏脂肪变性的机制：蛋氨酸、胆碱缺乏 磷脂酸胆碱合成减少 VLDL分泌受阻 甘油三酯出肝受阻 脂肪浸润肝细胞（脂肪变性）34,MCD饲料成分的改变：,果糖比葡萄糖更有效诱导小鼠的肝细胞损伤35 。,饱和脂肪比非饱和脂肪能加速肝脏脂肪氧化并诱导促炎基因表达35 。 相对于奶油，橄榄油诱导肝脏甘油三酯堆积，鱼油降低肝脏胆固醇水平36 。,22,给大鼠饲喂CD饲料7周后，血脂水平升高并诱发胰岛素抵抗37 。饲喂10周后，诱导肝脏脂肪变性、肝炎及肝损伤,且体重下降37 。,CD饲料（胆碱缺乏饲料）：,HFD饲料（高脂饲料）：, 诱导SD大鼠体重增加，体内脂肪堆积及胰岛素抵抗38 。 不能诱导肝纤维化，只能诱导轻度的肝脏脂肪变性27 。 添加胆固醇的HFD饲料，能诱导LDLR（-/-）小鼠肝脏脂肪水平升高并产生大小泡型脂肪变性39 。 VD缺乏的HFD饲料能使SD大鼠NAFLD恶化40 。 在35kcal%脂肪的HFD饲料中用中链甘油三酯替代长链甘油三酯，可以阻止大鼠的肝脂肪变性41 。 加果糖/蔗糖水的HFD饲料能诱导小鼠的肝纤维化42 。 母体在妊娠期与哺乳期就进行HFD饲喂的小鼠后代比那些离乳后才进行HFD饲喂的小鼠对NASH的发病更加易感43。,中链脂肪酸（MCFAs）比长链脂肪酸（LCFAs）水解能力强6倍，且MCFAs水解对胆盐和胰酶的依赖性较低，MCFAs的吸收不经过淋巴系统而直接入血由肝门静脉入肝，可以不依赖肉碱载体而直接进入线粒体氧化供能。MCFAs几乎不参与脂肪酸的从头合成，在体内很少沉积91。,王倩等2007年用改良的高脂饲料（猪油10%+蔗糖5%+胆固醇2%+胆酸钠0.5%+丙硫氧嘧啶0.2%+基础饲料82.3%）饲喂SD大鼠5周能成功地构建非酒精性脂肪肝大鼠模型，主要表现为大鼠体重与对照组无显著差异，光镜下可见肝细胞内弥漫大量的脂肪空泡，电镜证实肝细胞内有大量脂滴92 。,刘贺荣等2010用高脂饲料（猪油10%+胆固醇1.5%+猪胆盐0.5%+基础料88%）饲喂昆明小鼠6周，成功建立非酒精性脂肪肝模型。具体表现为小鼠肝细胞明显肿胀，肝组织内可见弥漫分布的大脂滴和微脂滴并散布全肝93 。,小结,啮齿类动物中的大鼠、小鼠是NAFLD很好的动物模型，也是目前研究中常用的动物模型。诱导NAFLD模型的饲料主要有高脂饲料、胆碱缺乏饲料、胆碱-蛋氨酸缺乏饲料三种。,2017/12/24,动脉粥样硬化,动脉粥样硬化,饲料诱导的啮齿类动物动脉粥样硬化/高胆固醇血症,动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种复杂的慢性病，是指动脉内膜下有脂质沉积，并伴有纤维基质成分和平滑肌的细胞增殖，逐步发展形成动脉硬化性斑块，斑块部位的动脉壁增厚、变硬，斑块内部的坏死组织与沉积的脂质结合，形成粥样物质的过程44。,模型饲料,饲料诱导的啮齿类动物动脉粥样硬化/高胆固醇血症,动脉粥样硬化的诱发因素之一是高胆固醇血症（TC和LDL-C水平升高）。富含饱和脂肪（SF）与胆固醇的食物，如Western-type diets，能引起血液循环系统中的胆固醇（尤其LDL-C）水平升高44。,模型饲料： 西方饮食模型饲料。,高脂 高胆固醇,动物模型,小鼠：,诱导动脉粥样硬化模型常用转基因小鼠：LDLR基因缺陷小鼠与apoE基因缺陷小鼠。 含胆固醇（0.15%-1.25%重量比）不含胆酸的Western-type diets能在12周后诱导LDLR基因缺陷小鼠明显的动脉粥样硬化病变52。 Western-type diets诱导apoE基因缺陷小鼠出现动脉粥样硬化早期病变只需6 周53。,原理：这些小鼠体内的突变体基因阻止了肝脏对血液循环系统中胆固醇的清除作用。,动物模型,大鼠：,Western-type diets(45kcal%脂肪，氢化椰子油、胆固醇1%，重量比、胆酸0.25%，重量比) 饲料都能诱导大鼠TC及LDL-C水平的升高47-49，若要诱导动脉粥样硬化还需添加0.5%的甲状腺激素抑制剂(2-硫脲嘧啶)50。 SD大鼠造模开始时一次性腹腔注射VD3 60万IU.kg-1，并饲喂高脂饲料（10%猪油+5%白糖+3%胆固醇+0.5%胆酸盐+0.2%丙基硫氧嘧啶+81.3%基础饲料）8周，可建立动脉粥样硬化模型。但该方法造模时大鼠的体重减轻,且死亡率达53% （周永刚等，2011）。 SD大鼠饲喂高脂模型饲料（1%胆固醇+0.5%胆酸钠+0.1%甲巯咪唑+5%猪油+93.4%基础料）2个月可建立动脉粥样硬化模型84。,VD3 升高血浆钙 破坏动脉内皮 加速血管壁脂沉积,动物模型,基因突变大鼠：,自发性基因突变大鼠（如JCR，LA-Corpulent）对食物中胆固醇敏感，能在没有胆酸或甲状腺激素抑制剂的参与下诱发高胆固醇血症51。,动物模型,仓鼠：（含有胆固醇酯转移蛋白CETP，而大鼠、小鼠没有）,CETP能将HDL微粒内的胆固醇转移至血浆LDL微粒中。,富含胆固醇（0.5%，重量比）与饱和脂肪（15-20%奶油脂肪，重量比）的西方饮食模型饲料（Western-type diets）能在没有胆酸的参与下在6周内诱导仓鼠血浆TC和LDL-C水平的升高及明显的动脉粥样硬化病变55。,动物模型,豚鼠：,豚鼠体内含有胆固醇酯转移蛋白CETP 57，西方饮食模型饲料能在没有胆酸的参与下诱导豚鼠的胆固醇水平升高和动脉粥样硬化58 。 豚鼠对膳食脂肪酸成分变化高度敏感，富含饱和脂肪酸SF（棕榈仁油）的高脂料中，添加0.3%胆固醇（重量比）可诱导豚鼠TC和LDL-C水平升高，在12周后诱发动脉粥样硬化59-61 。 高糖（42Kcal%）适度高脂（35Kcal%脂肪）高胆固醇（0.25%重量比）的饲料容易诱导豚鼠的动脉粥样硬化62。,小结,西方饮食模型饲料诱导啮齿类动物动脉粥样硬化（AS）是目前广泛应用的模式化饲料。不同啮齿动物（如大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、基因敲除鼠）其造模特点不同，因此应根据研究目的进行选择并配套相应的模式化饲料。,2017/12/24,高血压,高血压,饲料诱导的啮齿类动物高血压表型,人类高血压的发病机制与遗传、环境等多种因素相关。高血压研究首选的动物模型是大鼠，包括选择性培育的纯合品系高血压大鼠（自发性高血压大鼠SHR、盐敏感性高血压大鼠Dahl SS）与封闭群大鼠（SD大鼠）。,高血压,高钠饲料是常用的高血压诱导饲料。,Lewis Dahl等根据SD大鼠对8%NaCl饲料的不同响应，从选择性近亲交配的SD大鼠中培育出了Dahl盐敏感性（Dahl SS，2-6周）与Dahl盐抵抗性（Dahl SR）大鼠模型63。 动物年龄在高血压的钠诱导中也起重要作用。SHR大鼠在5-6周龄就会自发性地血压升高64 。 在饲料中添加7%NaCl或1%生理盐水能增加SHR大鼠的血管阻力，从而加剧SHR大鼠的血压升高65,66。,随着血液循环系统中钠水平的升高，细胞内的水分会在渗透压的作用下释放至血液循环系统，从而引起血管壁受压升高,摄食4%NaCl纯化饲料的Dahl SS大鼠后代无论离乳后是否继续摄食高盐饲料，其血压都是偏高的。这预示母体在妊娠内过度摄食高盐饲料可能会导致其后代患高血压68。 NaCl含量正常,富含果糖或蔗糖(60Kcal%)的饲料能诱发高血压动物模型(Dahl SS大鼠、SHR大鼠)的血压升高70-74 。,影响高血压表型的其他膳食因素,粗饲料中的大豆（粗饲料常见蛋白质来源）与纯化饲料中的酪蛋白（纯化饲料主要的蛋白质来源）相比，大豆能抑制SHR大鼠的高血压发病69。 减缓高血压发病的饲料诱导方法：在饲料中补充额外的钾盐成分，可阻止由8%NaCl饲料诱发的高血压的发生76,77。 在饲料中添加抗氧化剂（维生素E、C），可使高血压模型大鼠的血压降低78-80。,影响高血压表型的其他膳食因素,大豆蛋白含有植物雌激素和染