微生物感染的诊断与防治

1,第十三章 微生物感染的诊断与防治,2,微生物学诊断Microbiological diognosis,病原学诊断,血清学诊断,直接依据,间接依据,第一节 微生物感染的诊断,3,（一）细菌学诊断,标本的采集和送检四原则,区别取材,尽快送检,无菌操作,妥善处理,4,无菌采集 严格无菌操作，避免标本被污染。标本收集于无菌容器中，容器须先经高压灭菌、煮沸、干热等物理方法灭菌，或用一次性无菌容器，而不能用消毒剂处理。,5,取样部位,不同疾病、不同时期取不同部位标本 如流脑病人取CSF、血液或出血瘀斑；伤寒病人在病程12周内取血液，23周时取粪便。尽可能取病变明显部位的材料 取局部病变标本，不可使用消毒剂，必要时以无菌生理盐水冲洗，拭干后取材。,6,早期采集,采集时间最好是病程早期、急性期或症状典型时，且必须在抗菌药物使用前，否则这份标本在分离培养时要加入药物拮抗剂。,7,一般标本采集后最好在2h内送检，大多细菌可4冷藏运送、特殊（如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌）需保温立即送检。粪便标本中杂菌多，常置于甘油缓冲盐水保存液中。,尽快送检、冷藏运送,8,（二）病原菌的检验程序,检查致病菌 1、形态学检查examination in morphology直接镜检：形态和染色性上有特征的致病菌，直接涂片镜检后有助于初步诊断。 如：痰中查抗酸性杆菌，脓液中找G+葡萄串状球菌，霍乱弧菌等。,9,葡 萄 球 菌,霍 乱 弧 菌,10,结核分枝杆菌,A.结核分枝杆菌培养的镜下形态(抗酸染色)B.结核分枝杆菌痰标本直接涂片(抗酸染色),11,2、分离培养（isolation and cultivation）： 所有标本均应作分离培养获得纯培养后进一步鉴定，根据不同要求选用不同培养基。 分离培养比直接涂片镜检阳性率高，但需时较久；大多细菌1624h，结核杆菌需48w。 分离培养是微生物学诊断的金标准。,12,分离培养isolation and cultivation,分离培养是微生物学诊断的金标准，是最可靠的传统诊断技术。（图为普通孵箱）,13,厌氧箱 厌氧袋,14,各种细菌所具有的酶不完全相同，对营养物质的分解能力亦不一致，因而其代谢产物有别，藉此可对不同致病菌进行鉴别（如肠道杆菌）。,3、生化试验,糖发酵试验,15,4、血清学试验：,含特异抗体的免疫血清未知纯种细菌进行血清学实验，可确定致病菌的种和型。常见有玻片凝集试验。,玻片凝集试验,16,5、动物试验：,主要用于分离、鉴定致病菌，测定菌株产毒性等。 常用动物：小鼠、豚鼠、家兔 接种途径：皮内、皮下、腹腔、肌肉、静脉、脑内等。,17,6、药物敏感试验,测定标本中致病菌对药物的敏感程度；对指导临床用药及控制感染有重要意义。 常用纸碟法和试管稀释法。,18,检测致病菌的成分,病原菌的抗原,病原菌的核酸：,免疫荧光ELISA对流免疫电泳,PCR杂交：Southern，检测DNA Northern，检测RNA 原位杂交 斑点杂交,19,20,分子生物学技术 molecular biological techniques,核酸杂交 nucleotide hybridization 原位杂交 in situ hybridization 斑点杂交 dot blot Southern blot Northern blot PCR 技术：多聚酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR ),21,（三）血清学诊断,采用已知的细菌或其特异性抗原，检测患者血清或其他体液中有无相应特异性抗体及其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。,22,在血清学诊断中，最好采取患者急性期和恢复期双份血清标本。 结果：以抗体效价明显高于正常人水平或患者恢复期抗体效价比急性期升高4倍方有意义。常用有凝集实验、沉淀实验、补体结合实验、中和试验、ELISA等。,23,肥达试验,玻片凝集实验,24,细菌学诊断基本方法,25,二、病毒学诊断,26,病毒诊断包括哪些步骤和方法？,27,1、采集时间：用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本，应采集病人急性期标本。血清学检查的标本最好取双份。 2、标本种类：根据不同病毒感染采集不同部位标本(如鼻咽拭子、脑脊液、血液、粪便或疱疹液)。,（一）标本的采集原则,28,3、标本运送：应立即送检，运送标本中注意冷藏。保存于含抗生素的运送液中。不能立即送检时应存放于-70低温冰箱或液氮内保存。 4、标本处理：有杂菌标本应用高浓度抗生素处理（4）并离心。,29,细胞培养（cell culture）动物接种（animal inoculation） 鸡胚接种 （egg inoculation）,（二）病毒的分离与鉴定,30,1、动物接种 最原始的病毒培养方法。根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位。 如： 狂犬病病毒 小鼠脑内 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔或脑内 乙型脑炎病毒 小鼠脑内优点：结果易观察，可建立动物模型缺点：有饲养条件要求，费用高，动物体内常 带有潜伏病毒,31,2、鸡胚培养,绒毛尿囊膜/尿囊腔/羊膜腔/卵黄囊,32,痘苗V、HSV,IFV、腮腺炎V,IFV,嗜神经V,33,优点：易管理，不带微 生物，成本较低缺点：操作程序复杂,34,流感病毒分离培养的最好方法是鸡胚接种。接种羊膜腔（初次分离），尿囊腔（传代）；然后取羊水或尿囊液做血凝和血凝抑制试验鉴定。血凝试验：羊水/尿囊液+鸡RBC 红细胞凝集表明有病毒存在和增殖,35,血凝实验,36,3、细胞培养,是从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。,37,病毒的细胞培养,细胞培养瓶,单层细胞,38,细胞培养的优点：,来源方便，容易选择易感细胞。无免疫力，利于病毒生长。培养条件易于控制：可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分。接种量大：细胞可以大量生产，而且还可较久地持续培养。动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制。加速病毒分离过程：病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高，而且分离过程可显著加速，早出结果。,39,（1）细胞类型,原代细胞 动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞经体外培养后可贴壁或悬浮生长。（人胚肺细胞，鸡胚细胞、猴肾细胞、兔肾细胞等）,40,二倍体细胞 在体外连续培养5060代仍保持其二倍染色体数目的细胞。为生产人用疫苗的首选细胞株。传代细胞 能在体外连续传代，来自肿瘤细胞或发生自发转化、突变的原代细胞或二倍体细胞株。,41,优 点 缺 点 用 途原代细胞 多种V敏感 来源困难、成本高、 分离 携带潜伏病毒 二倍体细胞 多种V敏感 来源易, 50代 诊断/疫苗制备传代细胞 无限传代，来源易 致瘤性 分离/鉴定/研究V,42,（2）病毒在细胞内增殖的指征,细胞的变化细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)： 病毒在细胞内增殖后，可引起细胞形态学改变，如细胞肿胀、变圆、皱缩、融合或细胞聚集成葡萄串状，甚至细胞溶解或脱落等，这种可在普通光镜下看到的由病毒增殖引起的细胞形态变化，称为CPE。包涵体,43,细胞病变效应（CPE）,44,45,包涵体形成,46,红细胞吸附现象 某些病毒感染的宿主细胞能吸附脊椎动物的红细胞。干扰现象,47,4、病毒的鉴定,（1）病毒种类与型别鉴定初步鉴定：动物感染范围及潜伏期、对鸡胚的敏感性、细胞形态变化类型、红细胞吸附、病毒干扰现象、血凝性质、理化性质（核酸类型测定、大小形态、乙醚敏感试验、耐酸试验）等。最后鉴定：主要是血清学方法（中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、IFA和ELISA等）和分子生物学方法。,48,（2）病毒感染性测定,50%组织培养感染量（ 50% tissue culture infective dose ，TCID50）： 引起半数培养细胞发生病变（CPE）的病毒量。蚀斑形成单位（ plaque forming unit，PFU）： 在细胞培养表面覆盖一层半固体物质使细胞病变形成蚀斑。,49,病毒标本（充分稀释） 单层细胞 37，60min，吸附，洗涤覆盖琼脂 37，35d观察蚀斑（中性红/结晶紫染色）,PFU/ml： 定量测定病毒感染性,50,（三）血清学诊断,中和试验：中和试验是指病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验。 可用来检查患病后或人工免疫后机体血清中抗体的增长情况，也可用来鉴定病毒或研究其抗原结构。中和抗体特异性高，维持时间较长，因此流行病学常用此法。,51,血凝抑制试验：许多病毒能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，称为血凝现象。这种现象能被相应抗体所抑制，称血凝抑制试验。常用于含血凝素的病毒（如流感病毒、乙脑病毒）的辅助诊断和流行病学调查。补体结合试验：可作为近期感染的指标。ELISA：可检测多种病毒抗体，应用广泛。,52,形态学检查1、光学显微镜检查 ： 检查包涵体2、电子显微镜检查： 如轮状病毒、冠状病毒等病毒抗原检查 有免疫荧光（IFA）、放射免疫技术、酶免疫技术（EIA）等。,（四）病毒感染的快速诊断,53,轮状病毒,54,特异性抗体（IgM）的检测： 如：HAV、风疹病毒和针对EBV早期抗原的抗体； 用于急性感染，特别是先天性感染的诊断。检测病毒核酸 ： 包括核酸分子杂交技术和PCR，如HBV、HCV、HSV、CMV等的检测。,55,三、真菌学诊断,（一）标本采集的原则,56,（二）病原性真菌的分离与鉴定,1.直接镜检不染色标本：皮屑、毛发、指（趾）甲屑等置玻片上，加10KOH、微微加温，软化角质。轻压盖玻片，使标本变薄透明，然后镜检。如观察到菌丝和孢子，可初步诊断。染色标本：GS、墨汁负染2.分离培养标本处理后接种沙保培养基或血平板上，观察菌落及菌丝孢子形态等加以鉴定，必要时作小培养。,57,3.动物实验4.核酸的检测5.真菌毒素的检测,58,第二节 微生物感染的防治原则,59,一、细菌感染的特异性防治,特异性防治是应用特异性免疫的原理，给机体注射或服用病原微生物抗原（包括类毒素）或特异性抗体以达到预防和治疗感染性疾病的目的。这种方式称为人工免疫。 人工免疫分为人工主动免疫和人工被动免疫两种。,60,（一）人工主动免疫,人为地将疫苗（vaccine）或类毒素接种于人体，使机体主动产生特异性免疫力的一种防治微生物感染的措施。 常用人工主动免疫制剂有：,61,常用制剂,疫苗 -灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、 核酸疫苗、重组活载体疫苗、转基因植物疫苗和治疗性疫苗。类毒素,62,1.死疫苗：选用免疫原性强的细菌经人工大量培养后，用理化方法杀死而成。如伤寒、百日咳、霍乱等。 优点：易于保存。 缺点：接种剂量大；维持时间短；接种次数多；注射的局部和全身性副反应较大；不产生细胞免疫应答。,63,2.减毒活疫苗：,用减毒或无毒力的活病原体制成；如BCG 优点：只需接种一次、接种剂量较小、 副反应轻微或无、免疫效果好且持久、能同时产生细胞免疫和体液免疫；以自然途径接种，有SIgA抗体的局部粘膜免疫形成。缺点：不易保存（冷藏且保存期短）、回复毒力的危险性,64,死疫苗与活疫苗的区别,65,3.亚单位疫苗：,用化学方法裂解和提取或通过基因工程产生的细菌保护性抗原组分制成的疫苗。如:脑膜炎球菌的荚膜多糖，乙肝疫苗等。,66,4.核酸疫苗DNA疫苗基因疫苗,将能编码诱发保护性免疫应答的病原体基因片段和能在真核细胞表达的质粒重组，直接注入宿主体内使其表达目的免疫原，进而诱导出保护性抗体和细胞免疫的新型疫苗。 核酸疫苗的出现与发展是疫苗发展史上的第三次革命。,67,类毒素：,外毒素经0.30.4%甲醛作用34周后，毒性消失仍保持免疫原性的制品。如白百破三联疫苗（DPT）是将白喉类毒素、百日咳死菌苗、破伤风类毒素混合而成。,68,（二）人工被动免疫,给机体注射含特异性抗体的免疫血清或纯化免疫球蛋白抗体，或细胞因子等制剂，使机体即刻获得特异性免疫力的过程，以治疗或紧急预防感染。人工被动免疫常用试剂有：,69,1、抗毒素： 一般用细菌类毒素或外毒素多次免疫马后采血，从血清中提取免疫球蛋白精制而成。抗毒素能中和相应的外毒素，阻断其毒性作用。例如用于白喉、破伤风等疾病。 注射前需做皮肤试验。 应早期、足量注射。,70,2、抗菌血清3、胎盘球蛋白/丙种球蛋白 主要用于免疫力低下的人或者球蛋白缺乏患者。4、免疫细胞和细胞因子 IFN-、IL、CSF等,71,区别要点 人工主动免疫 人工被动免疫免疫物质 抗原或类毒素 抗体或细胞因子免疫出现时间 慢，24周 快，立即免疫维持时间 长，数月数年 短，23周主要用途 预防 治疗或紧急预防,人工主动免疫和人工被动免疫,72,（一）病毒感染的预防人工免疫对于预防病毒性感染有重要意义。,二、病毒感染的防治原则,73,1人工主动免疫传统疫苗 1）灭活疫苗 2）减毒活疫苗,Fig Edward Jenner vaccinating (inoculating) James Phipps with cowpox material.,74,目前常用的灭活疫苗有流行性乙型脑