技能考核内容--细胞

鸡胚成纤维细胞原代培养鸡胚成纤维细胞原代培养 实验材料 用品实验材料 用品 鸡胚 9 11 日龄 器材 平皿 倒置显微镜 二氧化碳培养箱 离心机 天平 离心管 100 目不锈钢网 镊子 眼科小剪 细胞计数器 枪头 移液器等 试剂 Hanks 液 完全培养液 血清 碘酒 酒精 方法方法 1 取胚 取 9 11 日龄鸡胚 碘酒 酒精消毒气室部 去除 气室部蛋壳 用无菌小镊取出鸡胚于无菌平皿中 2 去头 爪 内脏 鸡胚组织 Hanks 液洗 2 次 除去红细 胞 剪成 1mm3组织块 用 Hanks 液洗 2 次 800rpm3min 去上清 3 加 2 倍体积胰酶搅拌消化 15 30min 分散好的细胞悬液 加完全培养基 通过不锈钢筛网 滤液离心 沉淀加完全培养液 分散 4 细胞计数 接种培养与分装 取单细胞悬液少量 进行 1 5 或 1 10 稀释后计数 然后调至细胞浓度为 1x106 ml 细胞计数方法 取细胞悬液 计数 4 角 4 个大方格细胞总数 用下式计数 培养细胞的活性检查培养细胞的活性检查 材料材料 1 细胞 2 0 4 w v trypan blue 75 乙醇 3 培养瓶 无菌吸液管 5ml 及 1m1 废液瓶 盖玻片 4 倒置显微镜 计数器 血球计数板 离心机 C02培养箱 超净台 枪头 移液器 方法方法 1 细胞悬液制备 1 选生长良好的细胞一瓶 轻轻摇动培养瓶 悬浮细胞碎片 吸出生长液 用 Hanks 液洗一次 2 加入适量 0 25 胰蛋白酶液 使消化液浸没细胞 置 37 培养箱 1min 左右 镜检 3 待细胞圆缩后 吸出消化液 4 置 37 培养箱 随时镜检 5 待细胞变圆 加入完全培养基 洗下细胞 吹打混匀 2 取细胞悬浮液 50ul 与等体积 trypan blue 混匀 3 取 10ul 混合液滴入血球计数板 于 100 倍倒置显微镜下观 察 活细胞不染色 死细胞则为蓝色 4 计数 培养细胞传代培养细胞传代 材料材料 1 细胞培养物 2 Hanks 液 0 25 胰酶 培养基 3 培养瓶 废液瓶 倒置显微镜 计数器 血球计数板 离心机 C02培养箱 超净台 离心管 枪头 移液器 操作方法操作方法 1 选生长良好的细胞一瓶 轻轻摇动培养瓶 悬浮细胞碎片 吸出生长液 用 Hanks 液洗一次 2 加入适量 0 25 胰蛋白酶液 使消化液浸没细胞 置 37 培养箱 1min 左右 镜检 3 待细胞圆缩后 吸出消化液 4 置 37 培养箱 随时镜检 5 待细胞变圆 加入完全培养基 洗下细胞 吹打混匀 按 1 2 或 1 3 分配到培养皿中 补足培养液进行传代培养 细胞冻存细胞冻存 材料材料 1 细胞培养物 2 培养液 0 25 胰酶 冻存液 枪头 移液器 冻存管 记号 笔 线绳 酒精灯 酒精棉球 液氮罐 冰箱 离心机 超净台 操作方法操作方法 1 选生长良好的细胞一瓶 轻轻摇动培养瓶 悬浮细胞碎片 吸出生长液 用 Hanks 液洗一次 2 加入适量 0 25 胰蛋白酶液 使消化液浸没细胞 置 37 培养箱 1min 左右 镜检 3 待细胞圆缩后 吸出消化液 4 置 37 培养箱 随时镜检 5 待细胞变圆 加入完全培养基 洗下细胞 吹打混匀 离 心 细胞沉淀按 1 5 xl06 m1 浓度 悬浮于冻存液中 6 分装于冻存管中 l ml 严密封口 注明细胞名称和冻 存日期 7 冻存 每分钟下降 1 度 冻存保沪液 10ml 生长液 6 9ml 二甲基亚砜 1 0ml 小牛血清 2ml 双抗 0 1ml 细胞复苏细胞复苏 材料材料 1 冻存细胞 3 培养液 抗生素液 4 细胞计数器 吸管 冻存管 记号笔 线绳 培养瓶 酒精灯 酒精棉球等 5 液氮罐 冰箱 恒温水浴锅 CO2培养箱 离心机 超净台 枪头 移液器 操作方法操作方法 1 取出冻存管 取出时应戴好手套和防护眼镜 迅速放入 37 40 水浴中使其在 l mi