医学微生物学病毒感染的检查方法和防治原则

病毒感染的检查方法与防治原则,CHAPTER 25,1）掌握病毒的分离培养方法；2）熟悉标本的采集与送检原则、病毒感染的快速诊断；3）了解病毒感染的免疫预防、抗病毒治疗。,学习要求,内 容,第一节 病毒感染的检查方法第二节 病毒感染的特异性预防第三节 病毒感染的治疗,一、标本的采集与运送,病人急性期标本,标本抗生素抑制细菌真菌繁殖,病变组织加入50甘油缓冲盐水低温保存，尽快送检。70保存,血清标本：在发病初期和发病后23W各取一份血清，对比双份血清抗体效价的动态变化。,:, 病毒的分离培养 病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定,二、病毒的分离培养与鉴定,病毒的分离培养方法：, 动物接种 鸡胚培养 细胞培养,:, 动物接种(animal inoculation),动物：鼠、兔、猴、黑猩猩等优点：结果易观察，可建立动物模型缺点：有饲养条件要求，费用高、动物 体内常带有潜伏病毒。 目前已很少应用。, 鸡胚培养(embryonated egg culture),受精卵,孵育9-14天,鸡胚,接种病毒,孵育2-7天,收获相应的材料进行鉴定,鸡胚接种部位：,Chick embryo inoculation,Chick embryo inoculation,Allantoic inoculation is done mainly for production of vaccine of influenza virus. 主要用于流感病毒疫苗的生产,Viral replication produces visible lesions (pocks), grey-white area in the transparent(透明的) allantoic(尿囊的) membrane.,Poxvirus inoculate in allantoic membrane痘病毒绒膜尿囊膜接种,优点：易管理 不带微生物 成本较低缺点：操作程序复杂目前用鸡胚培养的病毒主要是流感病毒, 鸡胚培养(embryonated egg culture),(3) 细胞培养(cell culture),根据细胞生长的方式分: 单层细胞培养（monolayer cell culture） 悬浮细胞培养（suspended cell culture）,根据细胞来源、染色体特征及传代次数分: 原代培养细胞 二倍体细胞株 传代细胞系或株,(3) 细胞培养(cell culture),原代培养细胞（primary cultural cells),组织 组织块 分散的单个细胞 单层细胞,剪碎 蛋白酶,(原代细胞),单层细胞,(次代细胞),传代培养,培养基,原代培养细胞（primary cultural cells),epithelial cells,特点: 对多种病毒敏感 生长能力有限, 获取成本高 可携带潜伏病毒应用: 病毒分离与鉴定 病毒学实验研究 不能用于制备疫苗,原代培养细胞（primary cultural cells),体外分裂50100代仍保持二倍染色体数目的单型细胞,特点: 对多种病毒敏感 不带异种蛋白(人源性) 不带病毒,无致瘤潜能应用: 病毒分离与鉴定 病毒学实验研究 制备疫苗,二倍体细胞株(diploid cell strain),fibroblastic cells,传代细胞系(continuous cell line ),特点: 对多种病毒敏感性高 繁殖能力强,传代时间长 有致癌危险(来源于癌细胞或突变的二倍体细胞株)应用: 病毒分离与鉴定 病毒学实验研究 不能用于制备疫苗,能在体外无限传代的细胞系。如 HeLa, Hep-2,epithelioid cells,:, 病毒的分离培养 病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定,二、病毒的分离培养与鉴定,病毒鉴定：, 病毒在细胞中增殖的指标 病毒形态学鉴定 病毒抗原鉴定 病毒基因鉴定, 细胞病变效应( cytopathic effect,CPE),病毒在敏感细胞内增殖引起特有的细胞病变。,CPE：病毒感染细胞发生形态改变,Syncytium formation in cell culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom).,CPE：病毒感染细 胞与邻近细胞融合,CPE：形成包涵体（inclusion body）,Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet., 红细胞吸附（hemadsorption, HAd）,受染细胞膜表面血凝素（HA） RBC表面HA受体, 干扰现象（interference）,风疹病毒人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（）,埃可病毒人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（）,人胚肾细胞,风疹病毒？埃可病毒,CPE(-)埃可病毒(+) 风疹病毒(+) CPE(+)埃可病毒(+) 风疹病毒(-), 细胞代谢的改变,细胞培养瓶 代谢变化-PH,病毒在细胞中增殖的指标细胞病变效应( cytopathic effect,CPE)红细胞吸附病毒干扰作用细胞代谢的改变,病毒鉴定：, 病毒在细胞中增殖的指标 病毒形态学鉴定 病毒抗原鉴定 病毒基因鉴定,:, 病毒的分离培养 病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定,二、病毒的分离培养与鉴定,病毒数量及感染性测定：,50%组织细胞感染量蚀(空)斑形成试验,病毒总量(活病毒+死病毒)：感染性病毒量:,血凝试验,50%组织细胞感染量(50% tissue culture infectious dose, TCID50),概念: 测定病毒感染细胞后引起50%细胞病变的最小病毒量。方法:一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标，以能使50%细胞感染的病毒的最高稀释度作为终点。最后用统计方法计算出50%组织细胞感染量。用途: 测定感染性病毒的量和毒力,分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释度的HCMV感染的HEL细胞,50%组织细胞感染量(TCID50),蚀(空)斑形成试验（plaque assay）,原理：适当浓度的感染性病毒在覆盖琼脂的细胞层上产生可见和可数的局部病灶称为蚀斑。一个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的，由蚀斑的数目可以计算出原始标本中感染性病毒的含量。,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,分别为10-1、10-2、10-3倍稀释度的HCMV病毒液感染的HEL细胞,蚀(空)斑形成试验（plaque assay）,用途： 测定感染性病毒量 单位: PFU (plaque forming unit)/ml 由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个空斑称为空斑形成单位。 分纯病毒,蚀(空)斑形成试验（plaque assay）, 已知抗原测抗体（诊断） 已知抗体测抗原（鉴定病毒属、种、 型、亚型）,三. 病毒感染的血清学诊断,(1) 中和试验(Neutralization test)(2) 血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test)(3) 免疫标记法(FIA、EIA、RIA) 蛋白印迹(Western blot),方法：,三. 病毒感染的血清学诊断,Immunofluorescense test,Immunofluorescense test,Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC),HEL细胞中CMV IE1蛋白的表达,Enzyme immunoassay (EIA),ELISA,Coloured wells indicate reactivity,AIDS的确诊试验,Western blot,数小时内出结果形态学检查病毒成分（抗原或核酸） 早期抗体检测（IgM）,四. 病毒感染的快速诊断,（一）形态学检查,电镜和免疫电镜检查 普通光学显微镜检查 包涵体,电子显微镜：可观察各种病毒的形态 但设备贵、操作复杂，应用受限光学显微镜：可观察大病毒（痘病毒）和包涵体 对一般病毒检测意义不大,呼肠病毒感染回肠上皮细胞电镜照片,Electronmicrographs,Inclusion body,Cytomegalic cell that contains a dense, owls eye, acidophilic intranuclear inclusion body,Negry body,（二）病毒成分检测,1.病毒蛋白抗原检测 免疫标记技术2.病毒核酸检测 核酸扩增技术 核酸杂交技术 基因芯片技术 基因测序,（三）早期抗体检测,可诊断急性感染 特异性IgM抗体：孕妇感染风疹病毒 检测早期抗原抗体是快速诊断的另一途径 EBV早期抗原抗体,香港大学专家：患者鼻咽标本Vero细胞培养CPE EM观察：冠状病毒随后加拿大和美国CDC等SARS国际协作组的多个实验室也培养出了冠状病毒利用免疫荧光法将分离病毒与SARS患者血清进行血清学检测，反应呈阳性从冠状病毒基因组的保守区设计引物，采用RT-PCR方法从培养上清中扩增出了冠状病毒基因测序经Genbank数据库同源性比对，发现同源性为64%左右,SARS冠状病毒的分离和鉴定,加拿大专家完成了全基因组测序发现与已知人和动物的冠状病毒的同源性差异较大确定为一种新的冠状病毒。荷兰的病毒学家：用这种冠状病毒感染猴子出现了与SARS病人相同的临床表现和病理特征再次从动物学实验证实引起SARS的病原体是这种冠状病毒WHO将其命名为SARS冠状病毒,SARS冠状病毒的分离和鉴定,微生物及其代谢产物 生物制品 动物免疫血清（biological products）免疫细胞 细胞因子 预防和治疗感染性疾病,灭活疫苗（inactivated vaccine）活疫苗（living vaccine）重组载体疫苗（recombinant carrier vaccine）亚单位疫苗（subunit vaccine） 化学提取或人工合成疫苗 重组疫苗（recombinant vaccine）核酸疫苗（nucleic acid vaccine）,一、人工主动免疫常用生物制品,二、人工被动免疫常用生物制品,免疫球蛋白 血清丙种球蛋白 细胞免疫制剂 IFN-、 细胞因子 IL-2、IL-6、IL-12 TNF 、CSF 淋巴因子激活的杀伤细胞 LAK细胞,1抗病毒的化学制剂：目前抗病毒化学药物主要有核苷类药物。（1）核苷类药物：通过阻抑子代病毒基因的合成与表达，抑制病毒复制 .常用药物有:用于DNA病毒感染:阿糖腺苷、碘尿苷、无环鸟苷（阿昔洛韦）、丙氧鸟苷；用于HIV感染:叠氮脱氧胸苷（AZT）广谱抗病毒:3-氮唑核苷，对多种RNA或DNA病毒有抑制作用。,第三节 病毒感染的治疗,（2）病毒蛋白酶抑制剂：通过抑制病毒蛋白酶的活性，阻止病毒的复制. 常用药物有印地那韦、利多那韦等，对HIV有一定抑制作用。（3）其它抗病毒药物：金刚烷胺或甲基金刚烷胺用于甲型流感的治疗，甲酸磷霉素用于疱疹病毒感染的治疗。,2干扰素及干扰素诱生剂 : 干扰素具有广谱抗病毒作用，主要用IFN-，副作用小，对某些病毒性疾病的防治有较好的效果 。3中草药: 黄芪、大青叶、板兰根、贯众。 4其他:单克隆抗体、治疗性疫苗、细胞因子等免疫制剂。,1. 名词解释: cytopathic effect（CPE）2. 分离病毒的标本有何要求？3. 常用的分离培养病毒的方法有哪些？各有何应用？4. 病毒在组织细胞中增殖的指标是什么？,思考题,从患者体内分离病毒，采集标本时的错误的是A 在发病早期采集B 选取正确部位取材C标本冷藏D标本尽快送实验室E疾病恢复期取材,细胞病变效应不包括：A细胞圆缩、脱落B细胞融合C形成包涵体D干扰现象E细胞裂解,预防病毒最有效的方法是使用：A抗毒素B抗病毒化学疗剂C中草药D疫苗E抗菌药物,下列不适于培养病毒的方法是A鸡胚培养B人工合成培养基培养C原代细胞培养D二倍体细胞培养E动物培养,不能作为病毒在细胞内生长繁殖指标的一项是A致细胞病变作用B红细胞凝集C干扰现象D细胞培养液变浑浊E细胞培养液PH改变,对治疗病毒感染无效的药物是A干扰素B抗生素C阿昔洛韦D黄连、黄岑E三氮唑核苷,同学们，大家好！我是汲蕊。曾在上一学期给大家教过人体寄生虫学，现参加了“全国微课教学比赛”，为争取理想成绩，为学校争得荣誉，请大家广为宣传，参与我