利用基因芯片分析拟南芥中参与蜡质生物合成的候选基因

利用基因芯片分析拟南芥中参与蜡质生物合成的候选基因摘要：植物表皮蜡质组成疏水层覆盖于植物器官的表面，构成一层屏障以抵抗不受控制下的的水分流失和生物胁迫。蜡质的生物合成需要大量酶的协同作用，主要参与长链饱和脂肪酸形成及转化成几种脂肪族复合物的过程。我们发现数据库中有282个候选基因可能在蜡质的合成，调节和运输中发挥作用。为了鉴定最有意义的候选基因，我们通过实施基因芯片试验来测定15d苗龄的拟南芥（地上部分）的204个基因的表达水平。发现样本中仅仅有25%的假定候选基因表达水平显著，所以基因数量的显著降低将值得利用反向遗传学的方法来表明它们参与蜡质的积累。我们鉴定出一个-酮酰基CoA合成基因At5g43760，它在大部分的组织和器官中受蜡质基因CER6的共同调节。通过比较我们表明在15d苗龄的叶片和茎秆中脂酰CoA还原酶和蜡质合成酶基因不表达，引发的问题就是关于参与乙酰还原途径的酶大约占据总蜡质的20%。引言 水是植物生存的必要条件。贯穿于植物生理，结构和形态适应的进化过程中，植物需要在恶劣的环境条件下为了生存而保持最佳的水分状态。事实上，众所周知早期陆生植物的古生物化石中就出现了发达表皮和气孔特殊结构1,2。这两种结构是植物在光合作用气体交换下控制水分流失到干燥的大气中所必须的3,4。 植物生长在一个暴露的环境中应该形成一种机制来抵御非控制下的水分流失。这种机制应该是有效的，光合辐射透明，灵活和自我愈合的。植物的角质层控制着表皮外侧细胞壁和植物临近大气层之间水分的流动，并具有以下特征：它的膜比较薄（0.02-10um厚度），该膜为一多糖聚合物（角质）和相关的溶剂可溶性脂类（蜡质）5。角质大多数是由C16和C18羟基脂肪酸通过酯键形成的三维聚合物6-10。 角质层的蜡质是一种由长链脂肪族化合物组成的复合物质结构，同时也含有萜类和次级代谢产物，如固醇类和黄酮类。角质层蜡质的物理和化学特性决定植物的主要功能。事实上，蜡质除了在保护植物的暴露部分免受非控制下水分的流失作用以外3,4，它还具有防止紫外辐射，减少灰尘、花粉和空气污染物沉积的作用11。除此之外，还能够确信植物表面的蜡质在抵御细菌和病原菌感染上发挥重要作用12，同时还参与植物和昆虫的互作。含有20-32个碳原子的饱和长链脂肪酸的形成需要大量酶的参与13，它们进一步的转化成集中脂肪族复合物形成了蜡质层（图1）。两种主要的蜡质生物合成途径共存于植物的表皮细胞：一种是酰基还原途径，主要产生伯醇和蜡酯，另一个是脱羰基途径，主要形成醛类，烷类，仲醇和酮类14。在不同种类的植物中已经分离出几个蜡质突变体11,14-16。拟南芥中的突变体loci被命名为eceriferum（cer），在这个模式植物中已经鉴定出了22个独立的cer位点。突变体显示出蜡质组成不规则或蜡质成分的整体减少17-20。过去几年中，五个CER基因已经被克隆出来（CER1,2,3,5和6），但是仅仅CER5和CER6相对应的蛋白质生物功能是确定的，他们分别编码ABC转运蛋白和一种延长酶复合物的缩合酶11,12。进一步的利用拟南芥cer突变体，将更多的编码参与蜡质生物合成的蛋白质基因进行克隆和分析。一个位于玉米中的GLOSSY8突变体（GL8）导致长于C24蜡质复合物水平的降低。后期显示出相对应的基因编码一种还原酶，其参与VLCFAs的合成22,23。蜡合成酶（脂酰基CoA:脂肪醇酰基转移酶），催化线性脂合成的最后一步，它是从发育的荷荷巴胚胎中被分离和纯化的。并进行了相对应基因的克隆24。近年来，WINI/SHINEI被进行说明，它是一个Arabidopsis thaliana乙烯响应类型的转录因子，其过量表达能够上调叶片和茎秆中蜡质的产生25,26。我们目前的认识所以被局限在不同植物种类的有限的基因数量上，几种方案已经被研究来探索蜡质生物合成的其它途径。这些方案中一部分主要依赖于对候选基因库的鉴定，这些候选基因在蜡质的合成，调节和运输上发挥作用，一旦预测了它们的功能，那么它们的同系物和表达类型也会被知晓。在最近的研究报道中，Kunst and Samuels 11建立了35个基因列表，其编码蜡质生物合成酶。我们利用他们的列表作为起点，经公开的数据库检测后增加到了147个候选基因（TIGR，TAIR，Arabidopsis膜蛋白库， Arabidopsis脂蛋白基因库）。而且，近来发现ABC转运蛋白在蜡质沉积中发挥作用21，我们添加了135个编码ABC蛋白的基因于列表中，使基因总数达到了282个。在已经鉴定出来的282个候选基因中，我们在15d拟南芥地上部分植物中研究了204个基因的表达：18个-酮酰CoA合成酶（KCS），2个-酮酰CoA还原酶（KCR），5个反式-2-烯酰CoA还原酶（ECR），6个酯酰-CoA还原酶（FAR），10个蜡质合成酶（WS），3个双官能团WS/DGAT（酰基-CoA：甘油酰基转移酶），37个脂转移蛋白（LIP），113个ABC转运蛋白和10个CER-相关基因。2.材料和方法2.1植株材料Arabidopsis thaliana常用的三种生态类型：（Ler-0，cer-1，cer3-1和cer6-2）种子是从诺丁汉拟南芥库存中心中获得的（库存号NW20，N31，N33和N6242）。种子表面消毒后放于含有发芽培养基的培养皿中27。种子4低温处理2d以确定正常萌发后再进行周期光照。将拟南芥植物栽种在长日照条件下（16h光照/8h黑暗）22， 80%相对湿度。播种15d后收集植株的地上部分，冰冻于液氮中，-80储存。拟南芥的表现型Columbia（Col-0）用来进行黑暗/光照试验，CER6和At5g43760mRNAs用来进行组织分析试验。种子的消毒盒植株的栽种依据上述描述进行。对于黑暗试验，将1/2数量15d苗龄的植株转移到黑暗条件下24h，其余的植物仍旧放在正常的条件下。然后，收集植树的地上部分，冰冻在液氮中，-80储存。对于Arabidopsis thaliana表达的研究，需要将植株栽种在长日照条件（16h 光照和8h黑暗），22和80%相对湿度。将培养皿中播种20d后的植株转移到土壤中，同样条件培养30d，然后收集植株冷冻于液氮中。2.2 RNA的提取和探针荧光标记为了减小杂株的可变性，将20个植株组织中的提取的RNA合并。对于表现型cer-2，cer3-1和Ler-0，分别进行RNA的纯化（仅对cer1-1）。利用氯化铯进行植株地上部分总RNA的提取。通过260nm分光光度法来确定RNA的数量，再利用凝胶电泳来分析核糖体RNA条带评价其完整性。对于每个基因芯片试验，利用安捷伦荧光标记试剂盒按照说明书（Agilent 技术），将20ugRNA用作模板来合成被标记的cDNAt探针。利用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP（Perkin Elmer/NEN）进行试验。2.3探针杂交，冲洗和扫描 cer突变体和野生型植株之间的比较研究中使用了14个Agilent拟南芥-1基因芯片。针对13704个拟南芥基因每个排列包含60-mers长度寡核苷酸特异性探针和440个控制位点。 每个芯片使用200ul的杂交液。杂交盒在60旋转设置为8的杂交箱（Robbins scientific）中培养17h。培养的后期，条带在室温下按照0.5SSC和0.1%SDS5min和0.06SSC2min.顺序依次冲刷。随后，室温下通过400g离心干燥。利用一个清晰度为10um的双激光芯片扫描仪在cyanine3 532nm和cyanine5 633nm条件下扫描杂交芯片面。2.4 数据分析 利用Agilent表征提取软件A.6.1.1定量的鉴定杂交点强度。通过使用小量信号排列和散点均匀度方法设置如下：均匀度的离散度标记，总体离散度的标记以及背景的差减。为了将不同芯片试验结果进行标准化，我们使用每个对照样本所获得的平均值（Ler-0）28。计算每个基因的平均信号强度和它们的标准偏差。2.5 Real-time PCR条件和分析 利用RNeasy 植物少量试剂盒来分离总RNAQiagen, USA).。利用含有DNase的DNA纯化试剂盒来处理纯化的RNA(Ambion, Austin, TX)，利用1.5%(w/v)验证RNA的完整性。依据oligo(dT)18引物和SuperScripti TMII反转录酶(Invitrogen, GmbH)说明书，将20ul反应体系中的总RNA(2 ug)进行反转录。获得的cDNA稀释10倍，2ul作为Real-time PCR试验的模板。基因特异性引物列于表1. 为了建立一个标准的定量曲线，每个PCR产物都需要在pGEM-T质粒中r(Promega, USA)被克隆。通过DNA荧光定量试剂盒来定量质粒(Sigma-Aldrich, France)。将质粒按106至102 copies/uL浓度进行稀释，用作Real-time PCR对照的摸板。所有的标准样本进行三次重复分析，实验样本进行四次重复分析。 Real-time PCR试验在a iCycler i (Bio-Rad,USA)上进行。在25ul含有1SYBR荧光定量混合物和30nM引物。热量曲线条件为953min 30s 1个循环，9530s 和601min 40个循环。每个曲线的数据采集和分析利用iCycler i iQ软件进行操作(version 3.0a, Bio-Rad)。 每个转录的相对拷贝数通过未知样本Ct值与每条标准曲线的插值来决定的。确定每个样本中的actin 2，EF-1-a和eIF-4A-1mRNAs的量，用来标准化具有差异的总RNA量 29。3.结果和讨论3.1 cer-突变体中蜡质基因表达的分析 为了研究新的拟南芥基因是否参与表皮蜡质的生物合成，我们将正常拟南芥植株和cer突变株之间的进行了对比分析。我们利用以下的标准来选择cer突变候选体：（）鉴定和克隆突变基因。（）清晰的确立了突变体的表型（）总蜡质条带或不规则蜡质组分的生物化学研究表现出显著的降低。基于上述标准，我们选择了cer6-2，cer1-1和cer3-1突变体。大量研究表明，这三个突变体在蜡质产生中存在着明显的缺陷17,18,30,31。将突变株种植，提取15d地上部分的RNA并纯化，用于基因芯片试验。我们选择生长阶段进行试验，因为在这个阶段cer突变株和野生型的叶片区域蜡质沉积的差异是具大的32。随后，14个独立基因芯片试验被实施：6个cer6-2/cer-0，6个cer3/Ler-0和2个cer1/Ler-0。对于6个CER基因的基因芯片获得的试验数据列于表2中。这些数据清晰的表明，在cer突变株和野生株之间标记的CER基因都没有显示出双重差异性表达。除了Real-time PCR试验证实这些结果之外（表2）。并且，选择的204个候选基因没有在基因芯片上显现出双重表达。尽管在蜡质合成中存在着显著地缺陷，然而这些试验数据表明cer6-2，cer1和cer3突变株中CER基因的mRNA稳定水平接近于正常值。我们总结出，通过正常植株和cer突变植株的基因表达比较来鉴定参与蜡质生物合成的基因是一个无效的方法。我们所以采用了另一种研究方式来筛选候选基因。3.2 15d野生型拟南芥地上部分蜡质基因的表达表皮细胞一旦暴露在空气并持续几周，蜡质就开始了积累5。在拟南芥中，每片叶子角质层蜡质的沉积在发芽的15d和25d是相似的，然而在同一时期叶片区域的增加很显著，表明在这些阶段蜡质的生物合成是非常活跃的32。在衰老的植株中，蜡质的生物合成似乎不太活跃：萌发40d后拟南芥叶片蜡质的积累降低到了60%32。这些发现说明了在植物萌发第4周的地上部分中参与蜡质生物合成的基因表达上升。然而，我们的研究仅仅致力于在拟南芥生长过程中一个蜡质生物合成基因，CER6基因的表达。在1d苗龄的中探测到了相应的mRNA，当苗龄达到8d的时候达到了最大的稳定水平，并在拟南芥叶片的整个生长过程都探测到了33。为了拓宽我们的视野，我们测定了萌发15-28d拟南芥种苗地上部分编码延长酶（KCRGLOSSY8和ECR TSC13）的2个CER基因叶片中的mRNA。我们采用了置于黑暗下24h的15d种苗作为样本对照。事实上，蜡质的积累是受光照调节的34CER6的转录受黑暗条件抑制33。我们结果是利用real-time PCR 获得的（表3）。对于每个基因的mRNA萌发后15-28d的稳定状态水平相似，由此说明了在这个时期蜡质生物合成的比率是上升至恒定。从放置于黑暗下24h的植株获得结果证实了这个说法。在缺乏光照的植株中CER6 mRNA的稳定水平CLossy8和TSC13是降低的。总之，这些结果显示出15d拟南芥种苗中蜡质基因的表达是上升的，我们利用这个标准来筛选候选基因。3.3基因芯片数据的分析 对于13704基因的研究（接近于拟南芥的半个基因组）平均强度大约在1600，2555个基因（18.6%）的信号强度平均强度。阴性对照的平均强度（每列180空点）是24629，6912个基因（总数50.4%）的信号值500，表明在样本中信号水平不被表达。 重要的是，利用基因芯片试验测定的相对表达水平与预先通过Real-time PCR技术是相似的。通过两种技术获得的数据表明CER6 mRNA是最丰富的，随后是GLOSSY8，TSC13和CER3mRNA（表3）。所以，对于这些基因，Real-time PCR技术和基因芯片技术获得数据之间的相关性是合理的。3.4 参与VLCFA生物合成途径的酶 主要的表皮蜡质成分是由带有C20-C32长度饱和的VLCFAs组成的13,14,35，所以在质体中蜡质生物合成途径的第一步发生在C18：0脂肪酸的延长。脂肪酸的延长需要4种酶促反应，主要通过KCS,KCR ,-羟烷基CoA脱水酶（DCH）和ECR来催化的。目前为止，我们没有关于DCH的信息，所以在这里我们仅仅讨论KCS，KCR和ECR的作用。KCS催化带有长链酰基载体丙二酰CoA的缩合反应。这是VLCFA合成的限速步骤，其决定着VLCFAs酰基长链的产生36。来自拟南芥的4种KCS已经被研究出来。单一的缩合酶，FAE1，催化种子中VLCFA的合成36,37，另一方面，KCS138，FDH39,40和CER630,41，参与蜡质成分的合成。Millar et al. 41研究在拟南芥的茎秆CER6的加倍KCS和FDH活性没有发挥显著的功能。另一种VLCFA缩合酶CER6030，与CER6的氨基酸序列高度相似，也没有显现出对茎秆表面脂质的合成发挥显著作用，同时在嫩枝的表达水平很低33。关于拟南芥脂质基因数据库的一项研究显示存在的16个KCS相关基因总数已达到21个。为了进一步的了解这个酶家族，我们利用CLUSTAL W来进行序列比对（1.83）43并利用TreeView构建了系统树44（图2）。从这个发育树中我们可以看出，KCS的四个家族并在拟南芥中也被预先的进行了描述。最小的家族由两个成员组成，分别为CER6和CER60。正如先前的研究，在种苗的地上部分中测定CER6的表达是高水平的。然而，CER60是大量表达的，并且要比CER6 表达水平高1/2的事实很令人惊讶，因为过去报道的这个基因的表达水平要比CER6低33。如前面研究所述，这也许就说明了在蜡质的积累过程中CER60发挥重要作用，并且在生长阶段要求高水平的蜡质积累33。从FDH家族的7个序列来看，有3个在我们的样本中是不表达的。在拟南芥脂质基因数据库的一项研究显示At5g49070和At1g71160不存在EST，表明这两个基因或许是假定的基因，或许是在罕见的生理条件下才表达的基因。关于At3g52160的一个EST在花朵的cDNA文库中被鉴定出来，然而，由于其在我们的样本中没有表达，所以不可能说这个基因在茎或叶片蜡质合成中发挥重要作用。依据当前的研究基础，FDH的表达是大量的，其与CER6表达量相似。另外3个基因，At5g04530，At1g07720和At2g28630彼此之间表达水平相互接近于中度。它们的表达水平暗示着在蜡质生物合成中可能会升高。在拟南芥基因组中相关的种子特异性缩合酶FAE1的6个基因被鉴定出来。其中之一，At4g34250在基因芯片中未显现出来，但是从拟南芥脂质基因数据库中7个种子cDNA数据库的5个EST数据表明KCS在种子的油脂产生中发挥重要作用。FAE136,37说明了这个作用，在我们的样本中我们并没有测定出关于这个基因的转录水平。所以在15d拟南芥种苗的地上部分表达出中度水平的3个基因：At1g19440，At2g16280和 At2g15090属于一个家族。这3个基因或许催化叶片和茎秆中的一个缩合反应类似于拟南芥种子中FAE1完成的功能。最后一个家族由6个成员组成，相对应的KCS1基因特征由Todd etal描述38。从我们排列中呈现的4个序列来看，两个基因表达水平为中度，At1g01120（KCS1）和At2g26640，其中一个At5g43760表达水平与CER6相当。利用real-time PCR技术对At5g43760基因的表达水平做进一步的研究。首先，我们比较了正常日照条件或24h黑暗条件15d苗龄植株相应的RNA表达水平。At5g43760 mRNA的数量在缺乏光照的条件下呈显著下降。我们测定了一个黑暗At5g43760 mRNA与光照条件下的比率为0.557，其与TSC13的表达量相当（表3）。我们也测定了不同拟南芥器官中相应转录水平的表达量并比较了携带CER6 mRNA的在组织上的分布（图3）。研究结果表明两个mRNA物种被共同调节，在茎叶中高度表达，在丛生的叶片、茎秆、花朵和果实中表达水平略低，在根中表达不显著。所以，植物地上部分At5g43760的大量转录，光照或黑暗试验不同器官CER6的表达说明了KCS在蜡质积累中发挥作用。然而，近来研究表明在酵母中At5g43760的基因产物可能催化VLCFAs的形成45。通过利用有效的4个SALK突变株来证明蜡质生物合成过程中这个基因的假定作用可能是有所提高的。最后，从18个KCS研究中发现，在植株的地上部分中有12个是表达的，在它们之中有3个mRNA的表达呈现出高水平：CER6、FDH和At5g43760。在VLCFA合成的第二个阶段需要将3-羟烷基-CoA还原成-酮脂酰CoA，这是由一个KCR催化的反应。近来在啤酒酵母中鉴定出一个假定的KCR、YBR159w46，并在拟南芥基因组中进行了同系物的研究，鉴定出来2个候选基因At1g67730和At1g24470。研究表明At1g67730功能互补于ybr159突变株，在玉米基因中At1g67730的突变体会导致蜡质的缺乏正如glossy822,23。没有记录关于At1g24470基因的生物作用。在我们的样本中测定了这2个基因的mRNA表达水平，获得数值为At1g67730 1971455（n=9）和 427217 （n =8)）At1g24470。这些结果表明At1g67730表达呈显著水平，正如期望的这个基因编码延长酶复合物的组成成分。另一方面，由于它的表达水平较低，在拟南芥基因组中鉴定出的在第二个KCR候选体在蜡质前体的延长过程中发挥重要作用，因为前体的延长是缓慢的。VLCFA合成的最终反应是通过trans-2、3Enoyl-CoA还原酶催化的。在酵母中鉴定出编码这组酶的第一个基因TSC1347。研究表明TSC13是酵母生存所必需的，它催化所有链延长过程中以乙酰CoA为底物脂肪酸延长的循环反应。利用TSC13蛋白序列鉴定出拟南芥基因组中的一个同系物At3g55360，其与哺乳动物的类固醇5-还原酶相似。关于TAIR数据库的进一步研究表明具有相似特征的5个基因被鉴定出来：At1g72590、At2g16530、At2g38050、At3g55360和At5g16010。5个序列比对后显示前3个序列相近，说明了它们或许退化相似的反应，但是它们在我们的样本中没有表达。相反，At3g55360和At5g16010的相对表达值分别是1833427 （n =8）和96361507(n =9)。如上所述，前者是TSC13同系物，其功能补充了酵母tsc13突变体48。测定At5g16010的表达水平显著的高于At3g55360，表明相应的蛋白在这个生长阶段发挥重要的作用。延长酶复合体合成后，VLCFAs或者进入酰基还原途径，主要进行乙醇和蜡质的转化，或者进入脱羰途径，而形成醛类、烷烃类、仲醇和酮类。3.5参与脂酰还原途径的酶 酰基还原途径是将VLCFA转化为长链的伯醇和酯类。在许多高等植物中，发现角质层的蜡质中具有这些分子，然而有一些将产生长链醇和脂肪酸合成的线性酯类从而作为种子油能源储存。事实上，我们对这个途径的了解还是来源于对荷荷芭种子的研究。酰基还原途径的第一步包括VLCFA前体伯醇的形成。这个反应是由脂酰CoA还原酶（FAR）催化的49。第一个FAR基因是从荷荷芭50中鉴定出来的，随后从拟南芥中鉴定出8个相关序列11。其中拟南芥的MS2编码花粉形成的必要物质膜特异性蛋白51。事实上，推测FAR类酶参与拟南芥角质层脂质的蜡酯部分醇类的形成过程。我们的结果不支持这个假设。6个FAR基因都没有出现在我们的排列中，也没有在15d植株的地上部分表达出显著的水平（表4）。关于其它的两个FAR基因，At3g56700和At4g33790，在TAIR网页中没有发现与At3g56700相关的EST，而来自NASCArrays的有效数据表明At4g33790仅在拟南芥的根部表达。总体来说，目前为止在拟南芥基因组中没有鉴定出来FAR基因在蜡质积累过程中发挥重要作用。这个途径的最终反应是由一个脂酰CoA催化的：脂肪醇酰基转移酶(E.C.2.3.1.75,蜡质合成, WS)。纯化的WS来自于荷荷芭的胚胎，并克隆相应的cDNA24。然后，荷荷芭WS的12个拟南芥同系物的ORFs被鉴定出来11,42，推测这几个基因是拟南芥叶片和茎秆中角质层蜡质产生的必要因子11。我们的结果不支持这个假设。10个WS基因都没有呈现在我们的基因芯片中，也没有在15d植株的地上部分呈现显著的表达水平（表3）。然而，在拟南芥数据库中也没有鉴定出任何WS的EST42。我们的研究表明在15d拟南芥叶片和茎秆中FAR基因和WS基因都不表达，这个结果出乎意料。酰基还原途径占居总蜡质数量的20%52，在Ler 基因型25d植株茎秆和叶片中伯醇和酯的数量分别占居总蜡质数量的5%和2.3%、 3.5%和19.5%20。为了解释这些矛盾的结果，我们提出了两种假设。第一种是FAR和WS酶的氨基酸序列参与蜡质合成过程伯醇和酯产生不同于荷荷芭种子酯的产生，所以它们没有被鉴定出来。事实上，一种新型的双官能团蜡质合成酶/脂酰CoA：甘油酰基转移酶在Acinetobacter calcoaceticus中被描述53。作者在拟南芥基因组中鉴定出11个双官能团酶相关序列，我们假定，它们在蜡质生物合成中发挥作用。在我们的芯片中发现了3个基因（At3g49210，At3g49190和At3g49200），但是各自的信号强度分别是272，243和301，表明在我们的样本中他们没有表达出显著水平。然而，从NASCArrays的数据表明，这个家族的其它两个成员At5g12420和At5g37300在不同的条件下表达量较低较显著，我们不能排除它们在蜡质的合成中发挥重要作用。第二种假设是蜡质和伯醇的合成途径是可选择的。事实上，早期的生物化学研究表明伯醇的产生可能需经历两个过程，并通过两个单独的酶来催化，一种是将VLCFAs还原成醛类的NADH依赖型酰基CoA还原酶，另一种是将醛类还原成伯醇的NADPH依赖型醛还原酶54。当证实了VLCFA通过一个存在于豌豆叶片49和荷荷芭50胚胎中的单一脂酰CoA还原酶（FAR）催化形成醇类后，这个假设被推翻了，但是在拟南芥种苗中这个说法至今为止没有被证实。3.6脱羰基反应途径 在拟南芥的茎秆中脱羰基反应占据总蜡质的80%。这个途径起始于膜结合脂酰CoA还原酶的VLCFA前体形成醛类产物。这些醛类物质通过醛类脱羟酶羟基化形成奇数链烷烃。随后的步骤在于烷烃的羟基化形成仲醇，仲醇氧化形成酮类。 惊讶的是，尽管这个途径提供了拟南芥蜡质的大量合成，然而关于编码四个不同酶类基因鉴定的信息特别少。对于cer1突变株报道说明了CER1编码一个醛类脱羰基酶18,55。CER1序列（At1g02205）的获得并没有帮助我们证实其生物化学功能56，玉米和Kleinia odoraCER1同系物的克隆增强了这些基因或许编码膜结合受体的可能性57。近来，两个研究团队同时的鉴定出一个新的拟南芥CER-1相关基因，命名为WAX或YRE58，59，CER1有30%的氨基酸被鉴定相出来。相应基因的突变体形成一个cer表现型，突变体蜡质成分的分析形成一种假设WAX2/YRE催化酰基CoA到醛类的转化58,59。 在拟南芥基因组中我们鉴定出5个CER-1相关基因：At1g、At1g02205、At2g37700、At5g28280和At5g57800。在我们的样本中仅有2个进行了表达，At1g02205/CER1（998401）和At5g57800/WAX2/YRE（2027144，n=9）,所以证实了它们在蜡质积累中发挥重要作用。3.7其它的Cer基因（CER2/CER3） Cer2蜡质组分的分析表明在C28和C30组件上是缺乏的，表明CER2蛋白在C26脂肪酸延长上发挥重要作用18,55。CER2基因特征不能提供其生物化学功能60,61，但是CER2蛋白在核膜上的定位表明其是一个在角质层蜡质积累的调控者62。近来，一个来自Catharanhtus roseus的乙酰CoA：脱4-O-酰基转移酶推动了拟南芥基因组中13个酰基转移酶相关序列的鉴定，包括CER263。有趣的是，鉴定出来的13个酰基转移酶相关序列包含在02458蛋白质家族中。在TAIR数据库中，我们鉴定出41个包含在02458蛋白质家族中的转移酶，并将它们的序列进行了比较（图4，补充的数据）。比对的结果表明大约有6个序列与CER2蛋白相关。其中4个mRNA的表达水平在我们的基因芯片试验中被测定出来。At3g23840和At2g46110在我们的样本中不被表达。有趣的是，CER2 mRNA的量是稳定的，从而说明了CER2是一种调节蛋白而不是一种生物合成酶。除此之外，我们发现At4g13840也称为类CER2，其在我们的样本中高度表达。不幸的是，关于这个基因功能信息几乎没有，要求我们对拟南芥突变体做进一步分析研究At4g13840是否在蜡质生物合成中发挥作用。 奇怪的是没有在拟南芥基因组中发现CER3基因（At5g02310）相关序列。cer3突变株的生物化学组分研究表明相应蛋白质参与脂肪酸的延长18。然而，CER3基因序列显示出相应蛋白质的1个假定的核定位序列和2个磷酸化位点参与细胞核蛋白质的转运15,64。这些发现引发出一种假设为CER3或许编码一个调控蛋白。了解到细胞核调控蛋白通常低水平表达，我们的结果与CER3的这个假设相矛盾。事实上，测定这个基因的相对表达水平为993307（n=9）呈显著水平，但是低于编码生物合成酶的基因CER6。这个结果通过我们的PCR试验被证实（表3）。3.8 蜡质的转运 经历合成到分泌途经后，蜡质成分积累在表皮细胞的质膜上。然后，它们必须离开